慢性心房顫動(dòng)患者心房肌KChIP2基因mRNA水平的定量檢測(cè)和表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-KChIP2的構(gòu)建.pdf

1、目的：心房顫動(dòng)(Atrial Fibrillation，AF)簡(jiǎn)稱房顫，是最為常見的快速性心律失常之一，其患病率隨著年齡的增長(zhǎng)而增加，容易引起心房?jī)?nèi)血栓、腦栓塞等嚴(yán)重并發(fā)癥，有很高的死亡率[1-3]。業(yè)已證明，房顫時(shí)，心肌細(xì)胞鉀通道、鈣通道等發(fā)生明顯改變，其電流水平和相應(yīng)的編碼基因和蛋白水平存在明顯的上調(diào)或下調(diào)[4-8]。人心肌細(xì)胞瞬時(shí)外向鉀電流(Ito)主要由Kv4-3(KCND3)基因編碼，是心肌復(fù)極化的重要離子流，決定動(dòng)作電位的早

2、期復(fù)極并且影響其它復(fù)極化離子流[9]。KChIP2(Kv channelinteracting protein 2，KChlP2)是心肌細(xì)胞瞬時(shí)外向鉀通道的重要調(diào)控亞單位，參與調(diào)控通道基因表達(dá)和電流特性，在Ito發(fā)揮正常功能中起著不可或缺的作用[10、11]。 本課題采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)通過對(duì)房顫時(shí)KChIP2和KCND3基因mRNA水平進(jìn)行定量研究，探討KChIP2在房顫中的作用和對(duì)于瞬時(shí)外向鉀通道的可能調(diào)控機(jī)制。

3、 方法： ①30例接受體外循環(huán)手術(shù)的風(fēng)濕性心臟病(rheumatic heart disease，RHD)患者分為兩組：竇性心律組(SR組)13例、房顫心律組(AF組)17例，取其常規(guī)切除的右心耳組織作為研究對(duì)象； ②提取心房肌組織總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和TA克隆技術(shù)構(gòu)建含有目的基因片段的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)曲線； ③以GAPDH為內(nèi)參照基因，采用SYBR Green I法實(shí)時(shí)熒光定量PC

4、R技術(shù)檢測(cè)慢性心房顫動(dòng)和竇性心律患者KChIP2和KCND3基因mRNA水平； 結(jié)果： ①總RNA質(zhì)量：提取的總RNA通過紫外分光光度儀測(cè)量，A260/A280在1.80-2.10之間，A260/A230在1.90-2.20之間，濃度大于300ng/μl，通過1％瓊脂糖凝膠電泳得出，28S帶和18S帶明顯，灰度比大于1，5S帶不明顯，無拖尾； ②標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線：標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2>0.99，K

5、ChIP2基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-0.23x+6.69(R2=0.994)，KCND3基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-0.20x+6.24(R2=0.996)，GAPDH基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線為)y=-0.23x+5.94(R2=0.998)，熔解曲線呈明顯單峰狀，退火溫度與預(yù)測(cè)值基本一致； ③SR組和AF組KChIP2/GAPDH比值分別為0.2200±0.0388(n=13)，0.1468±0.0452(n=17)，AF組KChIP2基因mRN