早孕小鼠子宮內(nèi)膜CRT的表達(dá)規(guī)律及意義.pdf

1、目的： 本研究運(yùn)用RT-PCR、原位雜交、Western blotting及間接免疫熒光組織化學(xué)等技術(shù)，檢測未孕及妊娠小鼠子宮內(nèi)膜CRT基因與蛋白的表達(dá)、分布規(guī)律、動(dòng)態(tài)變化以及對胚胎植入的影響，有助于從分子水平探討CRT在胚胎正常著床過程中的分子調(diào)控機(jī)制，為了解人類正常生殖過程機(jī)制和生殖方面疾病的診斷、治療奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.建立NIH小鼠妊娠動(dòng)物模型，隨機(jī)將孕鼠分為7組作為實(shí)驗(yàn)組，未孕小鼠作為對照組，收集未

2、孕和孕d1、d2、d3、d4、d5、d6、d7的子宮內(nèi)膜組織，分別于-80℃凍存?zhèn)溆谩?2.運(yùn)用RT-PCR和原位雜交檢測CRT mRNA在小鼠子宮內(nèi)膜的表達(dá)規(guī)律； 3.運(yùn)用間接免疫熒光組織化學(xué)及Western blotting法檢測CRT蛋白在小鼠子宮內(nèi)膜表達(dá)水平； 4.于孕3天晚8時(shí)小鼠子宮角注射CRT反義寡核苷酸，于孕8天觀察著床胚數(shù)。 結(jié)果：： 1.RT-PCR分析表明，各組小鼠子宮內(nèi)膜均

3、有CRT mRNA，但妊娠小鼠子宮內(nèi)膜表達(dá)明顯高于未妊娠，且隨著妊娠天數(shù)的增加呈逐漸增加的趨勢，在妊娠d4、d5呈現(xiàn)最高峰。 2.原位雜交結(jié)果與RT-PCR結(jié)果基本一致。雜交陽性信號定位于基質(zhì)細(xì)胞、腺上皮以及腔上皮的胞漿中，為紫藍(lán)色細(xì)砂樣至黑紫色粗顆粒狀。 3.間接免疫熒光組織化學(xué)結(jié)果顯示，CRT蛋白在妊娠與未妊娠小鼠子宮內(nèi)膜均有表達(dá)，但妊娠子宮內(nèi)膜表達(dá)明顯高于未妊娠。妊娠d4、d5達(dá)到最高峰，與妊娠d4、d5相比妊娠d

4、6、d7略有下降，但顯無著意義(P＞0.05)。CRT蛋白綠色熒光陽性信號主要定位于基質(zhì)細(xì)胞、腺上皮以及腔上皮的胞漿中。 4.Western blotting結(jié)果與間接免疫熒光組織化學(xué)結(jié)果基本一致，并且表達(dá)的是46kDa CRT5.CRT反義寡核苷酸宮內(nèi)注射顯示，與對照組相比CRT反義寡核苷酸注射組的胚泡著床數(shù)量明顯減少(p＜0.05)。 結(jié)論 1.CRT基因及蛋白在未孕及早孕小鼠子宮內(nèi)膜均有表達(dá)，并且妊娠鼠子宮

5、內(nèi)膜CRT的表達(dá)明顯高于未孕子宮內(nèi)膜，提示CRT可能涉及到胚胎著床的整個(gè)過程并可能扮演重要的角色。 2.CRT在植入窗口期的高表以及在小鼠子宮內(nèi)膜的分布變化提示CRT可能參與了胚胎著床最初的黏附過程，通過促進(jìn)細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)的黏附而使子宮內(nèi)膜容受性達(dá)到最佳狀態(tài)，從而影響滋養(yǎng)層細(xì)胞與子宮內(nèi)膜的相互作用以利于胚胎的植入。 3.CRT反義寡核苷酸在基因水平阻斷其翻譯成蛋白質(zhì)，進(jìn)而阻斷其生理功能，發(fā)現(xiàn)著床胚泡數(shù)明顯減少，推測其很