高胰島素對早孕小鼠子宮內膜功能的影響.pdf

1、目的：激素在胚胎植入過程及妊娠的維持中均起著重要的調控作用。以往對妊娠中激素的研究多集中于雌激素和孕激素與子宮內膜功能的關系，關于胰島素是否參與了妊娠早期子宮內膜容受性及蛻膜化建立的研究報道甚少?，F有研究發(fā)現子宮內膜上存在胰島素受體。臨床高胰島素血癥的育齡婦女（如肥胖患者），大多數伴有不孕和早期流產。因此，本研究擬從子宮內膜容受性和子宮內膜蛻膜化兩個角度，探討高胰島素對早孕小鼠子宮內膜功能的影響，以了解胰島素對妊娠過程的調節(jié)，為臨床高胰

2、島素血癥導致的不孕癥、自然流產的診斷與治療尋求新的手段。
　　方法：
　　1、建立高胰島素小鼠模型：實驗組采用長效胰島素長時間梯度劑量皮下注射，對照組用同等劑量生理鹽水皮下注射的方法構建動物模型。監(jiān)測小鼠血糖及體重。23天后，采用Elisa方法對小鼠血清胰島素水平進行檢測，判斷高胰島素小鼠模型是否建立成功。
　　2、建立小鼠妊娠模型：高胰島素小鼠模型建立成功后，將胰島素處理組和對照組的雌性小鼠與正常雄性小鼠交配，晚上8

3、點左右合籠（雌性：雄性，2:1），次日早上8點左右檢查陰栓?？吹疥幩ǖ臑槿焉锏?天（D1），苦味酸標記受孕小鼠。收集D4、D5、D6、D7和D8天孕鼠子宮內膜組織。人工誘導蛻膜化模型：將胰島素處理組和對照組的雌性小鼠與輸精管結扎的雄性小鼠合籠交配，次日看到陰栓的為假孕第1天（PD1）。小鼠假孕4天（PD4）一側宮角注射玉米油100μl誘導蛻膜化，對側宮角不注射作為對照，于 PD8處死，收集子宮組織。
　　3、高胰島素對早孕小鼠子宮

4、內膜功能的影響：Elisa方法檢測小鼠血清胰島素、孕酮和雌二醇水平；解剖觀察子宮大體形態(tài)；HE染色法觀察子宮的微細結構；實時定量熒光PCR，蛋白質印跡法和免疫組織化學檢測 D4和 D5天小鼠子宮內膜容受性相關標記物 Esr1、Esr2、Pgr和Hoxa10的表達及D6、D7和D8天小鼠子宮內膜蛻膜化相關標記物Pgr、Esr2、Bmp2和Prl的表達。western blot對mTOR信號通路子宮內膜容受性相關分子的表達進行分析。最后，計

5、數并比較胰島素處理組與對照組孕鼠的妊娠天數及每窩幼崽數。
　　結果：
　　1、高胰島素小鼠模型的構建及血清激素分析：胰島素處理組小鼠血糖及血清胰島素水平顯著高于對照組，模型構建成功。此外，胰島素處理組小鼠血糖和HOMA值顯著高于對照組，提示胰島素處理組小鼠出現胰島素抵抗。血清激素檢測結果顯示，胰島素處理組血清E2顯著低于正常對照組（P＜0.05），P4顯著高于對照組（P＜0.05）。
　　2、高胰島素影響妊娠早期小鼠的

6、子宮內膜容受性：胰島素處理組與對照組比較，D4和D5天子宮的大體形態(tài)及微細結構沒有顯著差異，且 D5天的胚胎著床點數量也沒有顯著改變（P＞0.05）。但是進一步檢測發(fā)現，D4天胰島素處理組孕鼠子宮內膜組織的Esr1、Pgr和Hoxa10 mRNA表達較對照組顯著增高（P＜0.05），而Esr2 mRNA表達下降。D5天胰島素處理組Esr2和Hoxa10 mRNA表達較對照組顯著增高（P＜0.05），Esr1 mRNA表達較對照組顯著降低

7、（P＜0.05），western blot檢測到其蛋白表達量與基因表達一致。免疫組織化學結果顯示：D4天對照組 Esr1、Esr2、Pgr和 Hoxa10在子宮上皮細胞和基質細胞的細胞核均顯現為棕黃色，表達均為陽性,胰島素處理組Esr1、Pgr和Hoxa10為棕黑色，表達為強陽性，而Esr2顯現棕黃色，表達為陽性。D5天對照組Esr2、Pgr和Hoxa10在子宮上皮細胞和基質細胞的細胞核均顯現為棕黃色，表達均為陽性,胰島素處理組Esr2

8、、Pgr和Hoxa10為棕黑色，表達為強陽性，而Esr1顯現棕黃色，表達為陽性。
　　3、高胰島素抑制孕鼠子宮內膜蛻膜化：D6天胰島素處理組子宮形態(tài)與對照組比較無顯著差別，D7和 D8天胰島素處理組子宮部分胚胎著床點形態(tài)與對照組相比體積變小。D6、D7和D8天胚胎著床點數量顯著減少（P＜0.05），且微細結構可見部分胚層發(fā)育不全。人工誘導蛻膜化模型小鼠子宮形態(tài)不規(guī)則，可見胞質空泡化的蛻膜細胞。在D6、D7和 D8天人工誘導蛻膜化模

9、型中，胰島素處理組孕鼠子宮蛻膜組織的Prl、Bmp2、Pgr和Esr2 mRNA表達均較對照組顯著降低（P＜0.05）；western blot檢測到Prl、Bmp2、Pgr和Esr2蛋白表達量也均較對照組顯著降低（P＜0.05）。Pgr和Esr2表達免疫組織化學結果顯示：在D6、D7和 D8天,對照組子宮上皮細胞和基質細胞的細胞核均顯現為棕黃色，表達為陽性，而在胰島素處理組顯示淺黃色，表達為弱陽性。在D6和D7天, Bmp2在D6和D

10、7天對照組子宮上皮細胞和基質細胞的細胞核均顯現為棕黃色，表達為陽性，D8天顯現為棕黑色，表達為強陽性，但在D6、D7和D8天胰島素處理組均顯現為淡黃色，表達為弱陽性。Prl在D6、D7和D8天對照組子宮上皮細胞和基質細胞的細胞核均顯現為棕黑色，表達為強陽性。而胰島素處理組均顯現為淡黃色，表達為弱陽性。
　　4、高胰島素影響妊娠早期子宮內膜 mTOR通路：對 D4、D5和D6天孕鼠子宮內膜 mTOR信號通路的相關蛋白 mTOR、p-

11、mTOR、p70S6K和p-p70S6K的檢測發(fā)現，胰島素處理組的p-mTOR和p-p70S6K蛋白表達均較對照組顯著增高（P＜0.05）。
　　5、高胰島素導致小鼠妊娠延長和產仔數減少：胰島素處理組的小鼠平均妊娠天數（21±0.71天）顯著高于對照組（18±0.50天）（P＜0.05）；胰島素處理組的小鼠平均每窩生的幼崽數量（10±0.50只）顯著低于對照組（13±1.12只）（P＜0.05）。
　　結論：
　　1、

12、胰島素處理組小鼠血糖和HOMA值顯著高于對照組，提示在高胰島素的作用下，小鼠出現胰島素抵抗。E2顯著低于對照組，P4顯著高于對照組，提示高胰島素導致孕鼠體內激素紊亂。
　　2、胚胎植入早期可以劃分為兩個關鍵的時期：第一期，子宮處于容受胚泡的狀態(tài)以使胚泡獲得著床的能力，此期也被稱為植入“窗口期”；第二期，胚泡完全被包埋入子宮內膜，子宮內膜蛻膜化反應。在植入“窗口期”，胰島素處理組孕鼠胚胎個數和子宮內膜的微細結構與對照組沒有顯著變化，

13、但是子宮內膜容受性相關基因及蛋白Esr1、Esr2、Pgr和Hoxa10表達異常，提示盡管在高胰島素的作用下胚胎可以著床，但早孕小鼠子宮內膜容受性輕微受損。
　　3、在子宮內膜蛻膜化期，胰島素處理組孕鼠胚胎個數顯著減少，且部分孕鼠胚胎著床點的大體形態(tài)異常，且子宮內膜蛻膜化的相關基因及蛋白Prl、Bmp2、Pgr和Esr2均表達異常。說明高胰島素能夠影響子宮內膜蛻膜化。
　　4、孕鼠血液中胰島素水平增高會導致延長妊娠，并且導致