莖環(huán)結(jié)構(gòu)探針的設(shè)計(jì)及其檢測(cè)致病菌的研究.pdf

1、繼Tyagi和Kramer于1996年提出分子信標(biāo)學(xué)說(shuō)之后，Bockisch等基于分子信標(biāo)檢測(cè)的原理提出了一種新穎、廉價(jià)的酶聯(lián)構(gòu)象轉(zhuǎn)換分析系統(tǒng)并在細(xì)菌核酸檢測(cè)中得到了應(yīng)用，即利用親和標(biāo)記了的莖環(huán)結(jié)構(gòu)寡聚核苷酸探針來(lái)檢測(cè)靶核酸。但是這種方法與分子信標(biāo)一樣在對(duì)于存在一個(gè)核苷酸誤配的時(shí)候能檢測(cè)出信號(hào)出現(xiàn)假陽(yáng)性。因此我們利用序列比對(duì)的方法在目的病原菌16s rRNA高度保守的區(qū)域?qū)ふ乙欢涡蛄胁⒃O(shè)計(jì)為莖環(huán)結(jié)構(gòu)探針的環(huán)序列，這段序列與其它的高度同源

2、菌種的16s rRNA基因序列片段差異兩個(gè)核苷酸以上，從而避免探針環(huán)序列與其他非目的病原菌核酸雜交時(shí)出現(xiàn)誤配一個(gè)核苷酸的情況，克服出現(xiàn)假陽(yáng)性的問(wèn)題。設(shè)計(jì)的探針一端固定在96孔酶標(biāo)板上，另一端標(biāo)記上親合大分子。當(dāng)沒有靶核酸的時(shí)候，親合分子緊密地靠近在固相支持物的表面，由于探針的閉合構(gòu)象使得酶連接的報(bào)告分子不能與親合分子結(jié)合產(chǎn)生信號(hào)；當(dāng)存在靶核酸的時(shí)候，探針的環(huán)序列與靶核酸完全互補(bǔ)配對(duì)使得環(huán)被打開，構(gòu)象發(fā)生變化呈現(xiàn)線性結(jié)構(gòu)，暴露在外的親合分

3、子與報(bào)告分子結(jié)合產(chǎn)生信號(hào)。這種結(jié)合了序列比對(duì)的新探針技術(shù)其靈敏度比其他常規(guī)核酸檢測(cè)技術(shù)至少高出一個(gè)數(shù)量級(jí)。本論文的研究?jī)?nèi)容包括以下兩個(gè)方面： 一、基于金黃色葡萄球菌16S rRNA 基因序列，采用序列比對(duì)設(shè)計(jì)了一種莖環(huán)結(jié)構(gòu)的寡聚核苷酸探針，根據(jù)分子信標(biāo)技術(shù)和酶聯(lián)免疫分析的原理，評(píng)估一個(gè)實(shí)驗(yàn)方法，即利用能構(gòu)象轉(zhuǎn)換的、固定化的莖環(huán)結(jié)構(gòu)探針酶聯(lián)檢測(cè)靶核酸。因?yàn)樘结樀沫h(huán)序列即為金葡球菌 16SrRNA 基因序列的其中一個(gè)片段，同其他菌種

4、的16S rRNA基因序列誤配2個(gè)以上的核苷酸，有效的排除假陽(yáng)性即不會(huì)出現(xiàn)誤配一個(gè)核苷酸的情況。 二、為了驗(yàn)證新實(shí)驗(yàn)方法能應(yīng)用在所有的靶細(xì)菌核酸檢測(cè)中，選取革蘭氏陽(yáng)性金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性大腸桿菌為研究對(duì)象，應(yīng)用此方法成功的分別檢測(cè)出金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。 本論文實(shí)驗(yàn)表明，在知道靶細(xì)菌基因序列前提下，通過(guò)生物信息學(xué)方法設(shè)計(jì)的專一性探針和酶聯(lián)構(gòu)象轉(zhuǎn)換分析系統(tǒng)能代替?zhèn)鹘y(tǒng)檢測(cè)技術(shù)，甚至能檢測(cè)含有變異的靶細(xì)菌和應(yīng)用到單核