噬菌體在致病菌檢測中的應(yīng)用.pdf

1、致病菌的快速、靈敏檢測將為食品安全、環(huán)境監(jiān)測、疾病的診斷與治療等提供重要科學(xué)依據(jù)。建立在抗體特異性識別基礎(chǔ)上的免疫分析方法是致病菌檢測最為常用的方法，然而特異性的單克隆抗體不僅價格昂貴，而且難以獲取。自然界中存在著各種各樣的噬菌體，為細(xì)菌的特異檢測提供了一個天然的寶庫。噬菌體能在活的具有感受性的菌體內(nèi)繁殖，并且每種細(xì)菌基本都具有特異的噬菌體。基于噬菌體的寄生專一性以及生長速度快等特點(diǎn)，噬菌體常被用來鑒定一些特定的致病菌。
　　

2、雙砷染料是諾貝爾化學(xué)獎獲得者錢永健實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的一種適用于活細(xì)胞蛋白標(biāo)記的熒光探針，它是一類含有雙砷基團(tuán)的有機(jī)小分子（如FlAsH-EDT2），能夠穿透細(xì)胞膜，與連在重組蛋白標(biāo)記的六肽標(biāo)簽CCXXCC序列（簡稱四半胱氨酸TC，其中X是除半胱氨酸外的任意氨基酸）發(fā)生特異性結(jié)合，生成強(qiáng)熒光的共價結(jié)合的雙砷染料-四半胱氨酸復(fù)合物（熒光強(qiáng)度約為FlAsH-EDT2的50000倍）。與其它的蛋白熒光標(biāo)記方法（如綠色熒光蛋白）相比較，四半胱氨酸六肽標(biāo)

3、記序列體積小，不會影響被標(biāo)記蛋白質(zhì)或細(xì)胞的正常生理功能。此外，雙砷染料具有量子產(chǎn)率高、穩(wěn)定性強(qiáng)、標(biāo)記速度快并且能夠提供除了熒光之外的其它讀出方式等優(yōu)點(diǎn)，是一種更理想的蛋白質(zhì)熒光探針。
　　 本論文的第一章為緒論，首先對噬菌體在致病菌檢測中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，隨后對課題研究的相關(guān)背景如噬菌體展示肽庫技術(shù)、雙砷染料-四半胱氨酸體系進(jìn)行介紹。
　　 第二、三章主要介紹利用噬菌體對細(xì)菌的專一寄生性，建立噬菌體與雙砷染料-四半胱氨酸蛋

4、白標(biāo)記的聯(lián)合運(yùn)用體系，發(fā)展新型的致病菌快速鑒別診斷方法。我們首先分別對噬菌體M13和T7進(jìn)行基因改造，在其外殼上插入四半胱氨酸序列(FLNCCPGCCMEP)。重組噬菌體侵染特異的宿主菌并在其體內(nèi)快速繁殖，噬菌體衣殼蛋白上所表達(dá)的四半胱氨酸序列與后續(xù)加入的跨膜雙砷染料共價結(jié)合，發(fā)出強(qiáng)烈的熒光信號，使細(xì)菌可在傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡上進(jìn)行檢測，擴(kuò)大了細(xì)菌的檢測種類。
　　 第四章是結(jié)合噬菌體展示肽庫技術(shù)，建立應(yīng)用于致病菌檢測的雙

5、功能噬菌體探針構(gòu)建實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺。通過重疊延伸PCR定點(diǎn)法突變M13KE質(zhì)粒的三個位點(diǎn)，在pⅧ基因區(qū)插入PstI和BamHI雙酶切位點(diǎn)，在多克隆區(qū)刪除PstI位點(diǎn)。在突變成功的噬菌體的pⅧ蛋白插入Streptavidin的特異識別序列-VSS片段，作為報告位點(diǎn)，在pⅢ衣殼蛋白中插入O157:H7的H7抗原的識別序列-LHI片段，作為捕獲O157:H7的位點(diǎn)。嘗試使用構(gòu)建成功的雙功能噬菌體作為探針在傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀上檢測O157∶H7。

6、>　　 第五章是利用實(shí)驗(yàn)室自行研制的超高靈敏流式檢測儀，發(fā)展噬菌體的絕對計數(shù)方法。我們采用SYTOX Orange熒光染料對噬菌體T7和M13的DNA進(jìn)行染色，進(jìn)而在雙通道超高靈敏流式檢測儀(HSFCM)上檢測。HSFCM可以檢測到單個T7和M13的微弱熒光信號，實(shí)現(xiàn)了對T7噬菌體的絕對計數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與傳統(tǒng)的平板計數(shù)法有良好的對應(yīng)關(guān)系。
　　 本論文的主要成果是：1、建立了雙砷染料-四半胱氨酸重組噬菌體體系，對細(xì)菌進(jìn)行特異性識