基于DNA催化頸環(huán)自組裝致病菌檢測新方法研究.pdf

1、近年來，細(xì)菌感染成為一個(gè)全社會(huì)共同關(guān)注的嚴(yán)峻問題。尤其是抗生素廣泛甚至不合理使用，導(dǎo)致耐藥性相當(dāng)嚴(yán)重。超級(jí)細(xì)菌的產(chǎn)生已引起醫(yī)學(xué)界廣泛關(guān)注。另外，在細(xì)菌感染的診斷、監(jiān)測以及醫(yī)院感染的流行病學(xué)調(diào)查、消毒滅菌效果的評(píng)價(jià)等方面，臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)也具有特別重要的作用。因此，建立一種通用、簡單、快速、價(jià)廉、靈敏、特異的對(duì)病原菌檢測方法顯得極其重要。本研究主要包括以下兩個(gè)部分：
　　1.基于DNA催化頸環(huán)自組裝高靈敏檢測肺炎鏈球菌的比色傳感研究

2、
　　肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae, S.pn）是一種常見的致病菌，可以引起一系列感染性疾病，如社區(qū)獲得性肺炎、中耳炎、腦膜炎和菌血癥等。本研究以肺炎鏈球菌 lytA基因的部分序列為靶物質(zhì)，結(jié)合一個(gè)DNA信號(hào)轉(zhuǎn)換器和頸環(huán)自組裝（catalyzed hairpin assembly， CHA）信號(hào)放大策略，構(gòu)建 DNAzyme比色傳感器對(duì)其進(jìn)行高靈敏度的檢測。將靶物質(zhì)DNA與一個(gè)轉(zhuǎn)換器頸環(huán)DNA相結(jié)合

3、，形成新的核酸序列并打開頸環(huán)，暴露出頸環(huán)干封住的核酸序列，以此觸發(fā)CHA循環(huán)放大反應(yīng)。催化頸環(huán)自組裝反應(yīng)后，產(chǎn)物含有大量自由的并且富含鳥嘌呤G的核酸鏈。當(dāng)氯化高鐵血紅素存在的情況下，可與富含鳥嘌呤的核酸鏈結(jié)合形成G-四聯(lián)體復(fù)合物，即DNAzyme。DNAzyme具有類辣根過氧化物酶活性,在H2O2存在的情況下，能夠催化底物2,2′-連氮基-雙-(3-乙基并二氫噻唑啉-6-磺酸)二價(jià)陰離子(ABTS2-)氧化成藍(lán)綠色物質(zhì)ABTS-。在最優(yōu)

4、條件下，50 pM-200 nM的濃度范圍內(nèi)吸光度值與合成靶序列的濃度對(duì)數(shù)成線性關(guān)系，最低檢測限是32 pM。該方法不僅成功地用于檢測PBS緩沖液中S.pn，其最低檢測線為156 CFU mL-1，還應(yīng)用于檢測臨床樣本中的 S.pn，并可通過肉眼分析結(jié)果。另外，該方法在近緣種鏈球菌和其他主要致病菌中展示了很好的特異性。因此該傳感器將能夠?yàn)榕R床病原微生物診斷提供有力的工具。
　　2.基于核酸適體的通用型比色傳感器直接檢測鼠傷寒沙門氏

5、菌
　　鼠傷寒沙門氏菌屬革蘭陰性腸桿菌，是引起急性胃腸炎的主要病原菌之一。目前致病菌的檢測方法主要有：傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)鑒定、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)。但這些方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、成本高、需要專業(yè)人員及較高實(shí)驗(yàn)條件等。因此，現(xiàn)場、快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測和鑒定致病菌極為重要。
　　本實(shí)驗(yàn)建立了一種基于核酸適體特異性識(shí)別靶細(xì)菌，利用CHA模板進(jìn)行信號(hào)循環(huán)放大的通用型比色傳感器，可對(duì)各種細(xì)菌進(jìn)行高靈敏檢測。

6、當(dāng)鼠傷寒沙門氏菌存在時(shí)，與特異性核酸適體結(jié)合釋放出CHA模板觸發(fā)序列，催化頸環(huán)自組裝，暴露G-四聯(lián)體與氯化高鐵血紅素結(jié)合，催化ABTS2-和H2O2產(chǎn)生顏色變化，根據(jù)顏色變化程度對(duì)靶細(xì)菌進(jìn)行定量分析。將該檢測技術(shù)應(yīng)用于PBS緩沖液中鼠傷寒沙門氏菌的檢測，最低檢測線可到103 CFU mL-1，用時(shí)僅2小時(shí)。同時(shí)，該方法僅僅通過改變轉(zhuǎn)換器的序列，實(shí)現(xiàn)對(duì)不同的靶物質(zhì)核酸和細(xì)菌的間接或直接檢測,展示了其通用性。所建立的簡單、通用的新方法已成功