基于DNA模板化銅納米簇的生物分子檢測(cè)新方法研究.pdf

1、近年來(lái)，金屬納米簇作為一種新興的納米材料得到了廣泛的研究及應(yīng)用。與有機(jī)熒光染料等傳統(tǒng)熒光探針相比，金屬納米簇顯示出更優(yōu)越的熒光特性，如良好的生物相容性、較強(qiáng)的光穩(wěn)定性以及較高的熒光量子產(chǎn)率等，在熒光傳感和生物成像領(lǐng)域顯現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。本文圍繞DNA模板化的銅納米簇在生物傳感領(lǐng)域的應(yīng)用，主要開(kāi)展了以下工作：
　　首先，本論文設(shè)計(jì)了一種啞鈴型雙鏈DNA探針作為合成銅納米簇的模板，同時(shí)利用E.Coli DNA連接酶對(duì)輔酶Ⅰ的高度依賴

2、性，并結(jié)合Klenow Fragment聚合酶的聚合延伸作用，發(fā)展了一種免標(biāo)檢測(cè)輔酶Ⅰ的熒光分析新方法。啞鈴型探針通過(guò)Klenow Fragment聚合酶的聚合延伸作用可以產(chǎn)生更長(zhǎng)的雙鏈DNA銅簇模板，從而使體系熒光信號(hào)大大增強(qiáng)。當(dāng)E.Coli DNA連接酶被輔酶Ⅰ激活后，啞鈴型DNA探針相鄰的5'端磷酸基團(tuán)和3'端羥基被連接起來(lái)形成一個(gè)封閉的“啞鈴”結(jié)構(gòu)，體系熒光信號(hào)無(wú)法得到增強(qiáng)。這個(gè)方法比較靈敏，檢測(cè)限達(dá)到了0.2 nM，并且在復(fù)雜

3、的生物體系中也實(shí)現(xiàn)了對(duì)輔酶Ⅰ活性的分析。
　　接下來(lái)，本論文基于富T堿基單鏈DNA模板化的銅納米簇和T4多聚核苷酸激酶的3'端去磷酸化活性，結(jié)合Klenow Fragment聚合酶的延伸作用，提出了一種免標(biāo)分析T4多聚核苷酸激酶及其抑制劑活性的熒光方法。由于T4多聚核苷酸激酶能夠催化DNA的3'端發(fā)生去磷酸化反應(yīng)，所以探針3'端的磷酸基團(tuán)被水解為羥基，再通過(guò)Klenow Fragment聚合酶的聚合延伸反應(yīng)生成與富T堿基互補(bǔ)的雙鏈

4、DNA結(jié)構(gòu)，致使富T堿基序列由于雙鏈化而不能作為模板合成銅納米簇。當(dāng)不存在T4多聚核苷酸激酶時(shí)，3'端磷酸化修飾的探針無(wú)法發(fā)生聚合延伸反應(yīng)產(chǎn)生雙鏈結(jié)構(gòu)，可利用富T堿基DNA單鏈合成銅納米簇，體系產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光信號(hào)。這種方法選擇性很高，檢測(cè)限達(dá)到了0.25 U/mL，同時(shí)還能實(shí)現(xiàn)復(fù)雜生物環(huán)境中T4多聚核苷酸激酶活性的分析檢測(cè)。
　　最后，本論文基于富T堿基環(huán)狀DNA探針為模板合成的銅納米簇設(shè)計(jì)了一種簡(jiǎn)單、靈敏、成本低、免標(biāo)檢測(cè)核酸外