基于納米生物傳感的藥物代謝研究新方法.pdf

1、細胞色素P450酶系（CYP450酶）在藥物代謝過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。通過體外模擬揭示CYP450酶對藥物的代謝機理和化學本質(zhì)，研究藥物對酶的誘導和抑制效應，檢測代謝產(chǎn)物的基因毒性，可以為新藥的設計和合成提供依據(jù)，對于人類健康具有重要的現(xiàn)實意義和實踐價值。由于傳統(tǒng)的體外藥物代謝研究方法面臨著耗時長、成本高等缺點，因此研究和建立廉價、方便、快速的體外藥物代謝研究方法日趨迫切。
　　針對這一研究目的，本文利用電分析化學和納米技術(shù)的創(chuàng)新

2、成果構(gòu)建CYP450酶體外代謝系統(tǒng)，借助氧化銦錫(ITO)納米粒子良好的導電性或碲化鎘量子點(CdTe QDs)優(yōu)良的光電性能，研究了納米材料上CYP450酶的電子傳遞機制，并用電極或QDs代替輔酶提供CYP450酶催化反應過程中需要的兩個電子，實現(xiàn)了對藥物的電化學或光驅(qū)動催化。此外，研究了摻氮碳納米管(NCNTs)的電催化性能，并將其應用于生物小分子傳感。具體研究內(nèi)容如下:
　　(1)通過結(jié)合ITO納米粒子優(yōu)良的導電性以及聚乙烯

3、醇(PVA)良好的生物兼容性，采用包埋法在玻碳電極表面構(gòu)建了基于電化學驅(qū)動的神經(jīng)型一氧化氮合酶加氧酶區(qū)(D290nNOSoxy)電催化系統(tǒng)，實現(xiàn)了D290nNOSoxy與電極之間快速的電子傳遞過程，其異相電子轉(zhuǎn)移速率常數(shù)（ket）為154.8±0.1 s-1。當四氫生物喋呤(BH4)和O2共存時，檢測到了D290nNOSoxy/ITO/PVA/GCE對底物Nω-羥基精氨酸(NHA)的電催化信號。由于一氧化氮合酶(NOS)和CYP450酶

4、同是一類含有亞鐵血紅素的酶系，在結(jié)構(gòu)、性質(zhì)上具有很大的相似性，這部分工作為構(gòu)建CYP450酶電化學生物傳感器做好了鋪墊。
　　(2)同樣采用包埋法將CYP2C9/CPR微粒體、ITO納米粒子和殼聚糖(CS)混合均勻，配制具有優(yōu)異酶活性的納米復合物，構(gòu)建基于電化學驅(qū)動的CYP450酶藥物代謝系統(tǒng)，實現(xiàn)了CYP2C9/CPR微粒體與電極之間快速的電子傳遞過程，其異相電子轉(zhuǎn)移速率常數(shù)(ket)為12.252 s-1。以藥物甲苯磺丁脲作為

5、模型底物，評價了該電化學驅(qū)動的藥物代謝研究方法的可行性，CYP2C9/CPR微粒體/CS/GCE對底物甲苯磺丁脲具有良好的電催化響應，其表觀米氏常數(shù)（Kmapp）為202.84μM。高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)檢測結(jié)果證明，在該催化體系中生成的代謝產(chǎn)物與體內(nèi)代謝產(chǎn)物一致。此外，通過該電化學系統(tǒng)檢測到CYP2C9的特異性抑制劑磺胺苯吡唑?qū)妆交嵌‰?-羥基化反應的抑制效應，其IC50值為1.592μM。
　　(3)基于CdT

6、e QDs與CYP2C9之間光誘導的電子傳遞過程(PET)，構(gòu)建了基于CYP2C9功能化量子點的光驅(qū)動的CYP450酶藥物代謝系統(tǒng)。通過CdTe QDs與CYP2C9之間的共價鍵合制備了CYP2C9/QDs納米復合物，隨著CYP2C9相對于QDs摩爾比的增加，CYP2C9/QDs納米復合物的熒光強度逐漸降低;將CYP2C9/QDs納米復合物共價組裝到ITO電極表面(CYP2C9/QDs/ITO)，CYP2C9/QDs/ITO上的陰極光電

7、流相比于QDs/ITO明顯增加，以上現(xiàn)象證明激態(tài)CdTe QDs能夠給CYP2C9活性中心提供電子。以此為基礎，選擇藥物甲苯磺丁脲作為模型底物評價了基于CYP2C9/QDs納米復合物的光驅(qū)動的藥物代謝研究方法的可行性。隨著體系中底物濃度的增加，CYP2C9/QDs/ITO上的陰極光電流逐漸提高，說明光驅(qū)動的藥物代謝行為的發(fā)生，其表觀米氏常數(shù)（Kmapp）為76.28±3.59μM，同時測得特異性抑制劑磺胺苯吡唑?qū)妆交嵌‰?-羥基化反應

8、的抑制常數(shù)IC50值為1.16μM。此外，研究了該光驅(qū)動的藥物代謝系統(tǒng)的催化機理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超氧化物歧化酶(SOD)的存在會大大抑制CYP2C9/QDs/ITO對底物甲苯磺丁脲的光電流響應，初步推測這是一個基于O2-自由基活化的催化過程。
　　(4)對比了摻氮碳納米管(NCNTs)和多壁碳納米管(MWCNTs)的電催化活性，結(jié)果表明堿性條件下氧氣還原反應(ORR)在NCNTs上經(jīng)歷的是快速的一步四電子過程，而在MWCNTs上經(jīng)歷的是

9、兩步兩電子過程。NCNTs對H2O2的氧化還原反應也表現(xiàn)出優(yōu)異的電催化行為，以此為基礎在+0.3 V構(gòu)建了電流型H2O2傳感器，它的靈敏度為24.5μA/mM，是MWCNTs的87倍。NCNTs膜具有很好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，無需電子媒介體的參與，通過檢測葡萄糖氧化酶/葡萄糖或膽堿氧化酶/膽堿在酶促反應過程中生成的H2O2即可實現(xiàn)對葡萄糖或膽堿的靈敏檢測。此外，對比了NO分子在NCNTs和MWCNTs上的直接電化學氧化行為。與MWCNTs相

10、比，NCNTs對NO氧化反應的電子轉(zhuǎn)移速率提高了0.5倍，安培檢測NO的靈敏度提高了1倍多。以此為基礎構(gòu)建了基于NCNTs的NO電化學傳感器，其線性響應范圍為3.6～151.2μM，靈敏度為0.124μA/μM，檢出限為0.729μM(S/N=3)。理論計算結(jié)果預測吡啶型N原子的存在是NCNTs對NO的氧化反應具有高催化活性的根本原因。
　　(5)合成了兩種1-芘丁酸(PBA)功能化的碳納米材料，分別為PBA功能化石墨烯(PBA/

11、G)和PBA功能化摻氮碳納米管(PBA/NCNTs)。通過溶液中的碳化二亞胺偶聯(lián)化學，將葡萄糖氧化酶(GOD)共價固定在PBA/G和PBA/NCNTs表面，分別得到納米復合物GOD/PBA/G和GOD/PBA/NCNTs，固定化酶在碳納米材料表面具有較高的負載量，同時檢測到了固定化酶與電極之間快速的電子傳遞過程?；贕OD/PBA/G和GOD/PBA/NCNTs納米復合物構(gòu)建的葡萄糖傳感器具有較高靈敏度和較低檢測限，并成功應用于人血清樣