基于表面分子開關(guān)的生物傳感器新方法研究.pdf

1、科學(xué)和技術(shù)發(fā)展最重要的挑戰(zhàn)之一就是進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)對(duì)微觀的控制和研究，這就意味著要利用化學(xué)手段自下而上(bottom-up)來構(gòu)建分子水平上器件和機(jī)器，即從原子或分子開始建造微觀結(jié)構(gòu)?！白韵露稀笔侵敢栽樱肿訛榛締卧?，根據(jù)人們的意愿進(jìn)行設(shè)計(jì)和組裝，從而構(gòu)筑成具有特定功能的器件。同時(shí)，隨著微電子技術(shù)和生物工程這兩項(xiàng)高科技的互相滲透，分子開關(guān)實(shí)際上已為研制分子器件提供了可能。所謂分子開關(guān)泛指結(jié)構(gòu)上組織化了的具有“開/關(guān)”功能的化學(xué)體系。它也

2、是指具有雙穩(wěn)態(tài)的量子化體系，當(dāng)外界光、電、熱、磁、酸堿度等條件變化時(shí)，分子的形狀、化學(xué)鍵的生成或斷裂、振動(dòng)以及旋轉(zhuǎn)等性質(zhì)會(huì)隨之變化，通過這些幾何和化學(xué)的變化，能實(shí)現(xiàn)信息傳輸?shù)墓δ堋?分子水平上的開關(guān)需要一個(gè)外部刺激來引起電子和原子核的重排，3種用來開啟化學(xué)體系功能的最重要的刺激是光能(光子)，電能(電子或空穴)和化學(xué)能(以質(zhì)子、金屬離子或特殊分子形式)。最常見的光化學(xué)激發(fā)開關(guān)過程與光異構(gòu)化和光誘導(dǎo)氧化還原反應(yīng)是相關(guān)的。如果輸入的

3、是電化學(xué)激發(fā)，當(dāng)然就是氧化還原反應(yīng)的誘導(dǎo)反應(yīng)，與化學(xué)激發(fā)相比，光化學(xué)和電化學(xué)激發(fā)的分子開關(guān)更容易發(fā)生且響應(yīng)迅速。利用電化學(xué)能代替化學(xué)氧化還原作用，具有開、關(guān)簡(jiǎn)便快捷的優(yōu)勢(shì)。況且，電化學(xué)技術(shù)也是監(jiān)測(cè)機(jī)器運(yùn)行的有用方式，電極則是分子系統(tǒng)與宏觀世界相連的最佳方式。電場(chǎng)控制的表面分子開關(guān)可以用于蛋白質(zhì)的可控吸附和分離．再結(jié)合分子設(shè)計(jì)、有機(jī)合成和高分子化學(xué)，還可以給這種表面引入親疏水功能團(tuán)或抗原抗體識(shí)別對(duì)等，方便的實(shí)現(xiàn)親疏水開關(guān)或者免疫開關(guān)表面。

4、 本論文主要?jiǎng)?chuàng)新之處是基于自組裝膜技術(shù)、電化學(xué)控制技術(shù)以及溫敏聚合物材料構(gòu)建具有表面分子開關(guān)功能的仿生界面，從而利用這些智能化表面對(duì)生物分子及其動(dòng)態(tài)相互作用過程進(jìn)行實(shí)時(shí)在線控制和檢測(cè)。智能化表面(smart surface)通常是指具有可操控開關(guān)功能的生物應(yīng)用表面。智能化表面性質(zhì)的可逆操控，是在外界激勵(lì)下發(fā)生的。它可以由聚合物、有序自組裝膜、納米材料(特別是金屬氧化物)等組成，激勵(lì)它發(fā)生性質(zhì)可逆轉(zhuǎn)化的因素包括溫度、光照、電場(chǎng)、p

5、H值、溶劑等等。在這些外界激勵(lì)下，表面分子可以發(fā)生可逆的構(gòu)象轉(zhuǎn)化、構(gòu)型轉(zhuǎn)化、氧化態(tài)的轉(zhuǎn)化等等，從而在宏觀上，使整個(gè)表面呈現(xiàn)出親疏水性、光學(xué)性質(zhì)、帶電性等性質(zhì)的可逆轉(zhuǎn)化，即可呈現(xiàn)出“開/關(guān)”的性質(zhì)。本論文通過構(gòu)建的低密度自組裝膜，在表面上形成電化學(xué)可操控的具有生物識(shí)別能力的親疏水開關(guān)，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)抗生物素一鏈霉親和素功能蛋白間微觀作用過程的快速、靈敏、可控檢測(cè)和表征。進(jìn)一步地，利用溫敏高分子材料poly(N-isopropylacryla

6、mide)PNIPAAm與抗BSA抗體合成生物復(fù)合物，構(gòu)建了具有溫度敏感開關(guān)功能的可再生免疫傳感器。該方法可保持生物識(shí)別體系的活性和環(huán)境，再生的抗原／抗體表面均可重復(fù)識(shí)別相應(yīng)目標(biāo)物，檢測(cè)靈敏度高、速度快，所構(gòu)建的溫敏開關(guān)免疫傳感器可重復(fù)使用30次以上，解決了目前免疫傳感器抗體表面僅能單次使用的弊端，同時(shí)為研究蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)相互作用過程提供了新手段。本論文共五章內(nèi)容，主要摘要如下： 第一章綜述了表面分子開關(guān)的研究現(xiàn)狀及其相關(guān)技

7、術(shù)在生物傳感器領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展。分子自組裝和高分子聚合物是構(gòu)建分子開關(guān)的兩條重要途徑。自組裝單分子層是構(gòu)膜分子與基底材料間發(fā)生物化作用而自發(fā)形成的一種熱力學(xué)穩(wěn)定、排列規(guī)則的單層分子膜。這種構(gòu)膜方式，可以容易的為表面引入各種各樣的功能團(tuán)，這就為制備具有多種不同功能的智能化表面打下了很好的基礎(chǔ)。溫敏材料是指對(duì)溫度可感知且可響應(yīng)并具有功能發(fā)現(xiàn)能力的一類材料。具有“溫度開關(guān)”特性的聚-N異丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)是近年來引起研究興趣的一類高

8、分子材料。利用它對(duì)溫度響應(yīng)的敏感性，使其在藥物緩釋、免疫分析、生命科學(xué)等研究領(lǐng)域都有著廣泛的潛力。 第二章介紹了基于人工自組裝膜技術(shù)構(gòu)建表面親疏水開關(guān)發(fā)展生物傳感器的新方法。本章利用環(huán)糊精作為巰酸分子間距有效的調(diào)控手段，以乙醇作為高效的洗脫溶劑，通過自組裝方法在金電極表面構(gòu)建了間距均一、性能穩(wěn)定的巰基化合物低密度薄膜，由此構(gòu)建了具有親疏水可逆開關(guān)的智能化表面生物傳感器。以高密度自組裝膜表面的覆蓋度為100％計(jì)算可知，α，β，γ三

9、種環(huán)糊精分子構(gòu)建的低密度自組裝膜表面的覆蓋度分別為61.2％， 45.3％和29.2％。通過改變外加電壓狀況，使巰基化合物構(gòu)型發(fā)生改變，從而實(shí)現(xiàn)表面的親水／疏水性能的轉(zhuǎn)換。通過質(zhì)譜，核磁，交流阻抗，QCM，熒光等多種檢測(cè)手段對(duì)膜表面可逆過程進(jìn)行了實(shí)時(shí)監(jiān)控。 第三章主要圍繞此類親疏水開關(guān)生物傳感器進(jìn)行抗生物素及鏈霉親和素可控組裝的應(yīng)用研究。本章采用熒光標(biāo)記抗生物素、鏈霉親和素功能蛋白分子作為研究對(duì)象，通過改變外加電流正負(fù)情況使得低

10、密度自組裝膜表面具有親疏水可逆轉(zhuǎn)換性能。在pH值為7.4的緩沖溶液中，兩種蛋白質(zhì)由于等電點(diǎn)的差異而帶上了兩種不同的電荷，由于表面電荷作用及親疏水性質(zhì)的轉(zhuǎn)換，兩種蛋白質(zhì)可以在外加電場(chǎng)作用下發(fā)生可控組裝行為。主要利用EQCM實(shí)驗(yàn)和熒光光譜實(shí)驗(yàn)對(duì)兩種蛋白質(zhì)的可控組裝進(jìn)行了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，對(duì)于Avidin蛋白在β-CD構(gòu)建的低密度自組裝膜上的組裝過程，將其在負(fù)電壓下組裝30分鐘后它的熒光強(qiáng)度是正電壓條件下的4.9倍。對(duì)于Streptavidin蛋白來

11、說，當(dāng)外加正電壓30分鐘后，在β-CD構(gòu)建的低密度自組裝膜表面上蛋白組裝量分別是負(fù)電壓條件下同種組裝膜的1.5倍。利用微電極中獲得的良好分離分析效果，我們還初步嘗試將之應(yīng)用于微流控芯片體系，發(fā)展了一種利用“分子開關(guān)”原理構(gòu)建的蛋白質(zhì)芯片。 第四章是基于溫敏聚合物的表面分子開關(guān)構(gòu)建及抗原抗體可逆識(shí)別界面的研究。本章主要研究溫敏高分子材料PNIPAAm與抗BSA抗體合成的生物復(fù)合物(bioconiugate)組裝到金表面與對(duì)應(yīng)抗原B

12、SA識(shí)別時(shí)的可逆過程。由于這種溫敏高分子材料的存在，這個(gè)結(jié)合過程與抗體．抗原直接結(jié)合的情況有很大變化，選擇不同分子量的聚合物進(jìn)行構(gòu)建，該材料對(duì)抗原結(jié)合過程中造成的空間位阻有所不同，結(jié)合量可通過測(cè)定QCM，交流阻抗法，天然PAGE膠以及熒光標(biāo)記抗原的光亮度加以定量。當(dāng)抗原抗體結(jié)合完畢后，改變?nèi)芤旱臏囟龋捎跍孛舨牧戏肿恿康牟町?，高分子量時(shí)隨著溫度升高，抗體結(jié)合位點(diǎn)附近的高分子材料會(huì)團(tuán)聚在已經(jīng)結(jié)合的抗原周圍，而且會(huì)產(chǎn)生較大的空間力以及疏水力

13、，從而將已經(jīng)結(jié)合的抗原從抗體結(jié)合部位頂開，使得所構(gòu)建的溫敏開關(guān)免疫傳感器具有良好的再生功能。高溫降至低溫過程中，免疫識(shí)別體系抗原抗體結(jié)合常數(shù)差別可以達(dá)到兩個(gè)數(shù)量級(jí)。高分子量聚合物構(gòu)建的免疫開關(guān)傳感器對(duì)于抗原抗體結(jié)合后表面的再生率最高可以達(dá)到89％以上，跟通常文獻(xiàn)中大量報(bào)道的有機(jī)溶液再生表面法(再生率80％-92％)相差很小，而且這個(gè)方法基本沒有破壞生物識(shí)別體系的活性和環(huán)境，抗原抗體均可重復(fù)利用，這種溫敏開關(guān)免疫傳感器可重復(fù)使用30次以上

14、，抗疲勞性較好。綜上所述，這種基于溫敏聚合物的表面開關(guān)可以在免疫生物傳感領(lǐng)域進(jìn)行廣泛的應(yīng)用。 第五章工作圍繞基于手性氨基酸抗體構(gòu)建電容型手性免疫傳感器進(jìn)行相關(guān)研究。利用自制手性抗體構(gòu)建高選擇性的新型電容型免疫傳感器，設(shè)計(jì)了逆向競(jìng)爭(zhēng)法進(jìn)行檢測(cè)，得到了很好的響應(yīng)，這一部分工作仍在進(jìn)行中。構(gòu)建的電容性手性免疫傳感器從所有的圖表中可以看出這種傳感器對(duì)于小分子的手性氨基酸具有很強(qiáng)的識(shí)別和分析能力，檢測(cè)限可以達(dá)到5 pg/mL，對(duì)氨基酸混合

15、物中痕量D型苯丙氨酸可以達(dá)到0.001％的檢測(cè)靈敏度。競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定靈敏快速，既可以測(cè)定D型、L型苯丙氨酸對(duì)電極表面半抗原與抗體免疫識(shí)別的抑制情況，還可以測(cè)定消旋體中單一構(gòu)型(D型)氨基酸含量，此方法對(duì)于混合氨基酸體系中痕量的單一構(gòu)型抗原檢測(cè)限比標(biāo)準(zhǔn)的手性色譜分析方法還要低一個(gè)數(shù)量級(jí)，具有高靈敏度、高選擇性的特點(diǎn)，為無標(biāo)記法檢測(cè)手性氨基酸提供了一種可行的檢測(cè)方法。具有操作簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好，成本低廉等一系列優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于手性物質(zhì)的快速在線分析對(duì)于臨