基于三鏈DNA分子開關(guān)的電化學(xué)生物傳感器研究.pdf

1、DNA分子開關(guān)是核酸分子的組裝體，可在兩種狀態(tài)中以可控的方式實(shí)現(xiàn)可逆切換，主要是靶標(biāo)分子和外界環(huán)境（溫度、pH和光等）因素誘發(fā)其狀態(tài)切換?；诖?，DNA分子開關(guān)被廣泛的用于生物傳感器的研發(fā)與設(shè)計(jì)，比如基于單鏈DNA分子開關(guān)和雙鏈DNA分子開關(guān)的電化學(xué)生物傳感研究。此類電化學(xué)傳感器具有高效、快速、簡易等優(yōu)點(diǎn)，然而，這些DNA分子開關(guān)在設(shè)計(jì)應(yīng)用時也存在一定缺陷，其中單鏈DNA分子開關(guān)大多需要對識別元件進(jìn)行信號標(biāo)記，進(jìn)而將影響識別探針的特異性

2、與親和力。同時由于單鏈DNA具有柔軟而松散的無規(guī)則特性，導(dǎo)致背景信號穩(wěn)定性較差。雙鏈DNA分子開關(guān)一定程度上克服了部分上述缺點(diǎn)，但存在分子開關(guān)狀態(tài)可逆性切換困難。為了解決上述的策略設(shè)計(jì)固有缺陷，我們寄希望于特殊構(gòu)型的三鏈DNA分子開關(guān)。三鏈DNA的構(gòu)型是基于Watson-Crick和Hoogsteen堿基配對原理，同時將第三條DNA鏈通過氫鍵作用特異地結(jié)合在雙鏈DNA的大溝中，平行或反平行纏繞在一起形成三螺旋結(jié)構(gòu)。該設(shè)計(jì)既可以有效地避免

3、對識別探針進(jìn)行標(biāo)記，緊密的剛性結(jié)構(gòu)也可以提高背景信號穩(wěn)定性，降低背景。另外，可以通過改變離子濃度或者溶液pH，調(diào)控切換DNA分子開關(guān)狀態(tài)。因此，本論文基于三鏈DNA分子開關(guān)的特殊構(gòu)型性質(zhì)，構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器用于分析檢測生物分子，主要開展以下研究工作:
　　一、基于核酸適體與靶標(biāo)結(jié)合誘導(dǎo)三鏈形成構(gòu)建電化學(xué)生物傳感平臺
　　本文通過核酸適配體與靶標(biāo)結(jié)合誘導(dǎo)形成三鏈DNA分子信號開關(guān)，構(gòu)建了一種簡便、靈敏的電化學(xué)生物傳感平臺。該

4、生物傳感平臺包含三個部分:兩端末尾分別修飾有亞甲基藍(lán)(MB)與巰基的信號報(bào)告探針(STP)，目標(biāo)核酸適配體探針(Apt)以及富含嘌呤堿基的三鏈形成探針(TFO)。首先，STP兩端分別與TFO以及Apt雜交形成雙鏈，通過Au-S鍵修飾到金電極表面上，由于DNA雙鏈具有剛性結(jié)構(gòu)，使STP上標(biāo)記的電信號分子MB遠(yuǎn)離電極，電信號較小，當(dāng)目標(biāo)物存在時，由于目標(biāo)物與Apt的識別作用，Apt遠(yuǎn)離電極表面，進(jìn)而誘導(dǎo)STP與TFO形成三鏈結(jié)構(gòu)，使MB靠近

5、電極表面，此時電信號顯著增強(qiáng)。本研究以凝血酶(Tmb)以及三磷酸腺苷(ATP)作為模式目標(biāo)物用來證明該傳感平臺的可行性，其檢測限分別為0.86nM和7.2nM。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明該方法有望作為一種通用的電化學(xué)生物傳感平臺廣泛應(yīng)用于其它生物分子的檢測。
　　二、基于三鏈DNA分子開關(guān)和聚合酶循環(huán)放大電化學(xué)檢測DNA
　　利用三鏈DNA分子開關(guān)具備識別元件免標(biāo)記和利于降低背景信號等優(yōu)勢，聯(lián)合Bst聚合酶的循環(huán)放大策略，發(fā)展了一種特異性

6、強(qiáng)和靈敏度高的DNA分子電化學(xué)檢測方法。該三鏈DNA分子開關(guān)由兩部分組成:一部分是信號報(bào)告探針A鏈，該鏈富含嘌呤堿基，同時5'端和3'端分別修飾有巰基和MB。另外一部分是識別元件探針(HP)，該鏈由兩端頸部富含嘧啶堿基和中間環(huán)部為與靶標(biāo)DNA(T鏈)堿基互補(bǔ)配對序列構(gòu)成。基于Watson-Crick和Hoogsteen的堿基互補(bǔ)原理，A鏈可與HP形成穩(wěn)定的三鏈DNA分子結(jié)構(gòu)，并通過Au-S鍵修飾到金電極表面。由于其剛性結(jié)構(gòu)，三鏈DNA分