基于核酸修飾電極的新型電化學(xué)生物傳感器.pdf

1、快速、廉價、高靈敏度和高選擇性檢測生命活動相關(guān)的蛋白質(zhì)與小分子、疾病相關(guān)的特征DNA序列以及環(huán)境毒性污染物是現(xiàn)代生物化學(xué)分析的重要課題，這一多學(xué)科的共性目標(biāo)促使了生物傳感器的出現(xiàn)和發(fā)展。電化學(xué)核酸傳感器是一類以核酸分子作為識別元素，以電極作為信號轉(zhuǎn)換器的生物傳感器。核酸分子探針具有結(jié)構(gòu)簡單、特異性強(qiáng)、靶物質(zhì)分子廣泛和易于大量商業(yè)化合成的優(yōu)點。電化學(xué)核酸傳感器結(jié)合了核酸探針的優(yōu)異性能和電化學(xué)檢測方法的高靈敏度特性，在現(xiàn)代生物傳感器研究領(lǐng)域

2、中處于主體地位。核酸探針在電極表面的穩(wěn)定固定、探針與目標(biāo)分子間的有效識別以及識別事件的靈敏電化學(xué)信號轉(zhuǎn)換，是構(gòu)建高性能電化學(xué)核酸傳感器的三個關(guān)鍵問題。此外，發(fā)掘核酸修飾電極的新性能、設(shè)計與制備新型核酸探針，對于擴(kuò)大電化學(xué)核酸傳感器的應(yīng)用范圍和開發(fā)新型高效傳感系統(tǒng)具有重要的意義。本論文圍繞這些電化學(xué)核酸傳感器研究中的共性問題，在核酸修飾電極的新用途、核酸探針固定新方法和高靈敏度信號轉(zhuǎn)換方法以及新型核酸探針設(shè)計等方面開展了一系列的研究工作，

3、主要內(nèi)容如下：
　　 (1)多巴胺在電沉積DNA修飾電極表面的電催化氧化檢測雙鏈DNA是一種具有規(guī)則雙螺旋結(jié)構(gòu)的陰離子聚合物，廣泛用作合成導(dǎo)電聚合物和金屬納米材料的分子模板。第2章的研究工作采用一步電沉積的方法將小牛胸腺DNA沉積于玻碳電極表面制成表面負(fù)電性的DNA修飾電極。修飾電極表面的負(fù)電性DNA分子層對中性pH值溶液中正電性的多巴胺分子表現(xiàn)出明顯的靜電吸附富集作用，可顯著增強(qiáng)多巴胺分子的直接電化學(xué)氧化電流；同時該電沉積DN

4、A修飾電極可以有效地分離多巴胺與電活性干擾組分抗壞血酸和尿酸的電化學(xué)氧化峰?；陔姵练eDNA修飾電極這種選擇性電催化氧化多巴胺分子的性質(zhì)，發(fā)展了一種簡單、快速、高靈敏度和高選擇性的多巴胺電化學(xué)檢測方法，有效地拓展了核酸修飾電極的應(yīng)用范圍。
　　 (2)基于T-Hg(Ⅱ)-T絡(luò)合與酶催化信號放大的電化學(xué)汞離子傳感器酶催化信號放大是生物傳感器系統(tǒng)中常用的一種高靈敏度信號轉(zhuǎn)換手段，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于免疫傳感和核酸分析。第3章的研究工作將酶

5、催化信號放大引入基于汞離子特異核酸修飾電極的電化學(xué)傳感體系中，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則和T-Hg(Ⅱ)-T絡(luò)合原理設(shè)計了兩條汞離子特異的核酸探針，包括巰基固定基團(tuán)標(biāo)記的捕獲核酸探針和生物素分子標(biāo)記的信號核酸探針。利用T-Hg(Ⅱ)-T絡(luò)合調(diào)節(jié)的核酸探針雜交和生物素-親核素結(jié)合系統(tǒng)將鏈酶親和素標(biāo)記的辣根過氧化酶(streptavidin-horseradish peroxidase，S-HRP)固定于電極表面，固定化的S-HRP催化過氧化氫將

6、對苯酚氧化為對苯醌，氧化性的酶催化產(chǎn)物對苯醌進(jìn)一步在基底電極表面被電化學(xué)還原，提供用于Hg2+定量分析的放大電流信號。該酶催化信號放大電化學(xué)傳感器對汞離子的檢測表現(xiàn)出很高的靈敏度和選擇性，汞離子濃度檢測線性范圍為0.5 nM～1μM，檢測限可低至0.3 nM。
　　 (3)基于鳥嘌呤四股螺旋-血紅素絡(luò)合物電化學(xué)催化信號放大的汞離子傳感器分子內(nèi)包含重復(fù)鳥嘌呤堿基(guanine，G)單元的核酸鏈可與血紅素分子(hemin)形成具有

7、類似于辣根過氧化酶催化活性的鳥嘌呤四股螺旋-血紅素絡(luò)合物(G4-Hemin)。在第4章，研究了通過核酸雜交固定于金電極表面的G4-Hemin絡(luò)合物的電化學(xué)性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)G4-Hemin絡(luò)合物在金電極表面表現(xiàn)出直接的電化學(xué)行為，并且可以顯著催化過氧化氫的電化學(xué)還原?；贕4-Hemin絡(luò)合物的電化學(xué)催化性質(zhì)，設(shè)計了一條同時包含Hg2+特異堿基序列和G4序列的信號核酸探針，該信號核酸探針可以選擇性識別Hg2+，同時可結(jié)合Hemin形成電化學(xué)催化

8、信號標(biāo)記?；谠撔滦秃怂崽结槪晒Φ貥?gòu)建了一個無需共價修飾信號標(biāo)記、電化學(xué)催化信號放大的高靈敏度和高選擇性電化學(xué)汞離子傳感器。
　　 (4)基于分子識別調(diào)節(jié)碳納米管隧道電流效應(yīng)的電化學(xué)傳感平臺經(jīng)由疏水作用吸附于烷基硫醇自組裝層上的碳納米管可以恢復(fù)電活性探針鐵氰化鉀被烷基硫醇絕緣單分子層抑制的氧化還原電流，表現(xiàn)出碳納米管的“隧道電流效應(yīng)”；單鏈核酸可通過分子內(nèi)堿基與碳納米管管壁間的π-π共軛作用穩(wěn)定地結(jié)合于碳納米管表面。第5章的研

9、究工作發(fā)現(xiàn)烷基硫醇自組裝層上碳納米管吸附層的“隧道電流效應(yīng)”可通過碳納米管表面結(jié)合的單鏈核酸探針與目標(biāo)分子間的識別反應(yīng)進(jìn)行靈活的調(diào)節(jié)，即核酸探針與目標(biāo)分子之間的結(jié)合可調(diào)控鐵氰化鉀在碳納米管吸附層上的隧道電流響應(yīng)。利用這一獨特的性質(zhì)，開發(fā)了一種基于新的核酸探針固定方法和信號轉(zhuǎn)換方法的電化學(xué)傳感系統(tǒng)，并實現(xiàn)了重金屬離子銀離子的高靈敏度和高選擇性電化學(xué)檢測。
　　 (5)基于發(fā)夾探針與酶催化信號放大的核酸掃描電化學(xué)顯微鏡研究第6章的研

10、究工作針對傳統(tǒng)三電極DNA電化學(xué)傳感體系中工作電極(即DNA修飾電極)表面電化學(xué)惰性常常造成電化學(xué)響應(yīng)信號靈敏度損失的缺點，嘗試將四電極體系的掃描電化學(xué)顯微鏡(scanning electrochemical microscopy，SECM)引入DNA電化學(xué)傳感器的設(shè)計與制備。在該SECM核酸傳感體系中，末端分別標(biāo)記巰基基團(tuán)和生物素分子的發(fā)夾DNA探針通過自組裝的方法固定于金電極表面，目標(biāo)DNA與發(fā)夾探針的雜交導(dǎo)致發(fā)夾探針末端的生物素分

11、子暴露于電極表面，進(jìn)一步通過生物素-親和素結(jié)合系統(tǒng)將鏈酶親和素標(biāo)記的辣根過氧化酶(streptavidin-horseradish peroxidase，S-HRP)固定，電極表面固定化的S-HRP催化過氧化氫氧化對苯二酚生成大量電化學(xué)氧化活性的對苯醌，然后采用SECM的“基底產(chǎn)生-探針收集”工作模式監(jiān)測酶催化產(chǎn)物對苯醌的還原電流并以此實現(xiàn)對目標(biāo)DNA的定量分析和電化學(xué)掃描成像。該SECM傳感體系對目標(biāo)DNA的檢測限可低至17 pM，并