表面等離子共振生物傳感器快速檢測(cè)點(diǎn)突變的新方法研究.pdf

1、近年來(lái)，單核苷酸多態(tài)性(SNPs)作為一類(lèi)能夠在基因組DNA中穩(wěn)定遺傳的生物標(biāo)記物被廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。研究表明，一些存在于基因編碼序列或調(diào)控區(qū)域的單堿基突變能夠?qū)е禄蚬δ艿奈蓙y，從而影響個(gè)體對(duì)某些特定疾病的易感性和對(duì)藥物反應(yīng)的差異性。因此，單堿基突變的檢測(cè)對(duì)于疾病的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、臨床診斷和治療發(fā)揮著重要的作用，特別是對(duì)于一些遺傳性疾病的早期診斷以及指導(dǎo)個(gè)性化用藥意義重大。到目前為止，許多新興的方法已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于SNP

2、s的檢測(cè)，其中生物傳感器發(fā)展尤為迅速，特別是表面等離子共振(SPR)生物傳感器，已經(jīng)發(fā)展成為了一種成熟的研究生物分子間相互作用的方法。SPR生物傳感器因其具有無(wú)需對(duì)分子進(jìn)行標(biāo)記、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)動(dòng)態(tài)反應(yīng)過(guò)程、分析性能優(yōu)越、樣本用量少、易于自動(dòng)化、檢測(cè)周期短等其他傳統(tǒng)方法所無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)，在核酸、多肽、蛋白質(zhì)等生物分子測(cè)定方面顯示出了巨大的應(yīng)用潛力。本研究將基因芯片技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)與SPR傳感技術(shù)整合起來(lái)，利用了巰基自組裝以及DNA聚合酶對(duì)錯(cuò)

3、配堿基的識(shí)別作用，原創(chuàng)性地提出了一種快速、簡(jiǎn)便、實(shí)時(shí)、免標(biāo)記、高靈敏的點(diǎn)突變檢測(cè)方法。本論文研究工作主要包括以下兩個(gè)部分:
　　1.表面等離子共振生物傳感平臺(tái)的構(gòu)建
　　本實(shí)驗(yàn)選用了BIACORE X分析系統(tǒng)和裸金芯片，采用分子自組裝技術(shù)在芯片金膜表面直接固定巰基修飾的捕獲探針構(gòu)建用于檢測(cè)的傳感芯片。在金膜表面，巰基被氧化后形成金硫鍵，由于Au-S鍵之間的共價(jià)結(jié)合力很強(qiáng)，從而保證了配體在芯片表面固定的穩(wěn)定性。用6-巰基-1-

4、己醇(MCH)對(duì)芯片表面進(jìn)行封閉，最大程度地減小非特異性吸附對(duì)響應(yīng)信號(hào)的影響。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，選擇70μl的進(jìn)樣體積進(jìn)行樣本分析，分別對(duì)2μl/min、5μl/min、7μl/min、10μl/min的樣本流速進(jìn)行了優(yōu)化，考察了不同樣本流速對(duì)檢測(cè)信號(hào)的影響。該分析過(guò)程耗時(shí)較短，每次檢測(cè)僅需15分鐘。分別利用NaOH溶液和不同pH的Gly-HCl溶液對(duì)芯片表面進(jìn)行再生，優(yōu)化再生條件，結(jié)果表明，芯片再生效果好，可重復(fù)使用30次以上。
　　

5、2.基于DNA聚合酶核酸延伸反應(yīng)的單堿基突變的檢測(cè)
　　將第一部分所構(gòu)建的SPR生物傳感器應(yīng)用于聚合延伸反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè)，建立一種靈敏性高、特異性好的點(diǎn)突變檢測(cè)新方法。在液相反應(yīng)中，利用DNA聚合酶對(duì)引物3'末端錯(cuò)配構(gòu)象的識(shí)別作用，在適宜的緩沖液和溫度條件下，以待測(cè)靶序列為模板進(jìn)行核酸延伸反應(yīng)，進(jìn)而將反應(yīng)產(chǎn)物注入Biacore X SPR系統(tǒng)中與芯片金膜表面修飾的捕獲探針進(jìn)行雜交檢測(cè)。對(duì)引物延伸反應(yīng)條件（Mg2+濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)