表面等離子體共振生物傳感器的構(gòu)建及其在病原微生物快速檢測(cè)應(yīng)用中的研究.pdf

1、背景：
　　 臨床上，感染性疾病是導(dǎo)致患者死亡的最主要原因之一。大量數(shù)據(jù)表明：近年來(lái)，隨著抗生素的濫用不僅加重了患者的負(fù)擔(dān)，而且導(dǎo)致了越來(lái)越多的耐藥菌株的產(chǎn)生，如VESA、MRSA，加大了疾病治療難度，抗腫瘤藥物、免疫抑制劑等藥物的使用以及人群老齡化和免疫力低下人群的出現(xiàn)，使感染性疾病發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)。創(chuàng)傷感染及其并發(fā)癥已成為患者死亡與傷殘的重要原因之一。而且全球日益惡化的自然環(huán)境和生態(tài)環(huán)境條件下所產(chǎn)生的新型疾病、愈演愈烈

2、的人獸共患疾病等烈性傳染病都使病原微生物的快速檢驗(yàn)顯得更加重要。因此，早期、準(zhǔn)確對(duì)致病病原微生物進(jìn)行診斷是確保提供有效治療方案，提高患者預(yù)后，進(jìn)一步降低其死亡率的最有效方法?？焖贆z測(cè)技術(shù)及小巧便攜式設(shè)備的研制將極大地豐富現(xiàn)有的檢測(cè)手段，促進(jìn)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷水平的提高，贏得患者救治的時(shí)間，解決臨床上急需解決的問(wèn)題，從而最大限度地降低傷亡率，提高我國(guó)的醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷能力。這在當(dāng)今全球大的自然災(zāi)害時(shí)有發(fā)生的情況以及新的公共衛(wèi)生形勢(shì)下尤其具有重要的意

3、義。
　　 傳統(tǒng)的病原微生物的檢測(cè)和鑒定主要是使用分離培養(yǎng)結(jié)合形態(tài)特性、生化鑒定、免疫分析的方法，存在操作復(fù)雜、特異性不強(qiáng)、所需時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)，且許多細(xì)菌培養(yǎng)要求高，生化特征、抗生素敏感型等表型特征不穩(wěn)定，易受到基因調(diào)控、質(zhì)粒獲失及技術(shù)操作等方面的影響。后期發(fā)展起來(lái)的分子生物學(xué)技術(shù)由于其高效、快速的優(yōu)勢(shì)迅速在分子診斷領(lǐng)域得到了飛速發(fā)展，其中以PCR 技術(shù)為核心的核酸擴(kuò)增方法使得微量靶分子的檢測(cè)成為可能。但是如何確保PCR 產(chǎn)物的檢

4、測(cè)特異性和效率是一個(gè)極待解決的技術(shù)難題。電泳技術(shù)簡(jiǎn)便快捷，然而其分辨率有限，只能作為定性分析方法。
　　 生物傳感器是較新的一門(mén)學(xué)科，然而其一誕生則在實(shí)驗(yàn)室診斷領(lǐng)域獲得了廣泛應(yīng)用。其檢測(cè)原理是將生物信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，然后再轉(zhuǎn)換為計(jì)算機(jī)可以識(shí)別的數(shù)字信號(hào)的過(guò)程。根據(jù)其轉(zhuǎn)換方式的不同，可以將生物傳感器分為電化學(xué)傳感器、石英晶體微天平(QCM)、表面等離子體共振(surface plasmon resonance, SPR)等。其中S

5、PR 生物傳感器，集高效、靈敏、特異、結(jié)構(gòu)小巧、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)于一身，目前已成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。它利用換能器，將待測(cè)的生物信號(hào)轉(zhuǎn)換為電、聲、光等可檢測(cè)的物理信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本中靶生物分子的檢測(cè)。
　　 本實(shí)驗(yàn)即是在前期研究平臺(tái)基礎(chǔ)上，將臨床常見(jiàn)的四種感染致病菌：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌為研究對(duì)象，充分利用細(xì)菌16S rDNA 序列的分子生物學(xué)特點(diǎn)，分別將生物素信號(hào)放大技術(shù)引入SPR

6、 生物傳感器，構(gòu)建新型多通道SPR 技術(shù)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，進(jìn)而建立一種操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性強(qiáng)的微生物病原菌快速檢測(cè)方法，為應(yīng)用于野外、自然災(zāi)害等特殊領(lǐng)域提供堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.在前期研究基礎(chǔ)上，對(duì)SPR 生物傳感器檢測(cè)平臺(tái)的硬件系統(tǒng)和軟件系統(tǒng)進(jìn)行改進(jìn)，增加溫控系統(tǒng)，加強(qiáng)電磁屏蔽，采用UMPHO-A450控制軟件，對(duì)傳感器檢測(cè)系統(tǒng)的穩(wěn)定性、重復(fù)性進(jìn)行評(píng)價(jià)。對(duì)芯片自組裝方法進(jìn)行改進(jìn)，采用SDS 再生液將親

7、和素修飾的寡核苷酸探針還原后再進(jìn)行SPR 掃描，探討探針固定影響因素，確定最適反應(yīng)條件。
　　 2.利用Vector NTi9.0軟件套組對(duì)目標(biāo)病原菌的16S rDNA 序列進(jìn)行分析，確定16s rDNA 保守區(qū)域序列和可變區(qū)域序列；利用Primer Premier 5.0軟件，針對(duì)16S rDNA保守區(qū)域序列，設(shè)計(jì)適用于目標(biāo)病原菌的PCR 擴(kuò)增通用引物；利用Array Designer 4.0軟件設(shè)計(jì)針對(duì)各目標(biāo)病原菌16S r

8、DNA 可變區(qū)域序列的特異性寡核苷酸探針。探討雜交反應(yīng)的影響因素，優(yōu)化反應(yīng)體系，初步建立感染常見(jiàn)病原菌SPR 生物傳感器檢測(cè)方法。
　　 3.以臨床200例臨床標(biāo)本為檢測(cè)對(duì)象，采用試劑盒法提取細(xì)菌基因組DNA，用于SPR 生物傳感器檢測(cè)；并以血培養(yǎng)鑒定法為參照方法，對(duì)建立的SPR 生物傳感器微陣列檢測(cè)方法進(jìn)行方法學(xué)比較和評(píng)估，確定臨床樣本檢測(cè)步驟。
　　 結(jié)果：
　　 1.成功構(gòu)建適合野外環(huán)境下小型化SPR 生物

9、傳感器檢測(cè)儀，檢測(cè)儀規(guī)格為8通道串聯(lián)檢測(cè)池，進(jìn)樣臺(tái)規(guī)格為4×4孔(1.5ml),4×8孔(0.5ml)，檢測(cè)模式為平行檢測(cè)，參考點(diǎn)：可根據(jù)需要設(shè)定1-3個(gè)參考點(diǎn)，進(jìn)樣流速范圍為5-378μl/min,流速控制精度為±1μl/min，系統(tǒng)溫度控制范圍為15℃-50℃(室溫25℃)，溫控精度±0.5℃，樣品回收方式為8通道可各自進(jìn)行樣品回收。檢測(cè)系統(tǒng)穩(wěn)定性良好，八通道間基本不存在干擾，達(dá)到了檢測(cè)系統(tǒng)的要求。
　　 2.利用設(shè)計(jì)的通用

10、引物可以一次性完成所有靶細(xì)菌16S rDNA 序列的順利擴(kuò)增，電泳條帶明亮清晰，具有較好的重復(fù)性。自行設(shè)計(jì)的探針特異性強(qiáng)、可靠性好，探針間Tm值相差僅為0.5℃，基本上具有相同的雜交條件，可用于傳感器微陣列系統(tǒng)的檢測(cè)。檢測(cè)最適雜交溫度為45℃，雜交檢測(cè)時(shí)間為90min。
　　 3.病原菌基因組DNA 試劑盒提取方法結(jié)果顯示，該方法操作簡(jiǎn)便、污染機(jī)會(huì)少，而且效果好，能裂解所研究的所有菌種，PCR 產(chǎn)物電泳條帶清晰明亮，無(wú)拖尾現(xiàn)象，

11、可作為有效的樣本前處理方法。檢測(cè)的200例臨床樣本中，其中195例傳感器檢測(cè)結(jié)果，與臨床檢測(cè)結(jié)果相符合，靈敏度為97.3％，特異度為98％，可靠性為90％。
　　 結(jié)論：
　　 1.我們所構(gòu)建的新型SPR 生物傳感器微陣列，降低了溫度和電磁效應(yīng)對(duì)檢測(cè)穩(wěn)定性的影響，極大的減少了各檢測(cè)通道之間的信號(hào)干擾，從而達(dá)到了傳感器陣列化的要求，為DNA 檢測(cè)提供了背景噪音低、性能穩(wěn)定的微陣列檢測(cè)平臺(tái)。
　　 2.自行設(shè)計(jì)的16

12、S rDNA通用引物可以一次性對(duì)所有靶細(xì)菌16S rDNA 序列的順利擴(kuò)增；設(shè)計(jì)的寡核苷酸探針特異性好，具有相同的雜交條件，較大的增加了傳感器微陣列的檢測(cè)通量，簡(jiǎn)化了操作步驟。
　　 3.構(gòu)建的SPR 生物傳感器檢測(cè)系統(tǒng)，可以在4小時(shí)內(nèi)同時(shí)檢測(cè)四種臨床感染常見(jiàn)病原菌，檢測(cè)方法具有較高的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性，技術(shù)穩(wěn)定簡(jiǎn)單易于掌握，成本低廉。為臨床病原菌的快速檢測(cè)乃至其他基因檢測(cè)提供一種新思路，有望克服臨床常規(guī)檢測(cè)方法存在的問(wèn)題，