快速檢測(cè)致病性微生物的免疫生物傳感器研究.pdf

1、食源性疾病不僅嚴(yán)重地?fù)p害人類的健康，也給經(jīng)濟(jì)造成重大影響，已成為國(guó)際上最突出的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。致病性微生物污染是影響食品安全的罪魁禍?zhǔn)?。傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)檢測(cè)方法雖然靈敏可靠，但費(fèi)時(shí)、操作繁瑣、檢測(cè)結(jié)果滯后。PCR、ELISA等快速檢測(cè)方法昂貴、只能由專業(yè)人員操作，體積較大，攜帶不太方便，不適合于現(xiàn)場(chǎng)或野外使用，而生物傳感器在微生物檢測(cè)的實(shí)際應(yīng)用中潛力巨大。
　　 免疫生物傳感器具有快速、便攜、特異性強(qiáng)、制作簡(jiǎn)單、識(shí)別靈敏等特點(diǎn)

2、，因此成為微生物檢測(cè)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本論文以代表性食源性致病菌大腸桿菌O157：H7和典型性禽流感病毒H5N1為檢測(cè)對(duì)象，結(jié)合納米技術(shù)與電化學(xué)阻抗譜技術(shù)，分別研究了壓電和電化學(xué)免疫生物傳感器用于致病性微生物的檢測(cè)方法。
　　 本文的主要內(nèi)容和研究結(jié)果如下：
　　 (1)研究了基于MPA自組裝膜技術(shù)制作的流動(dòng)式壓電免疫傳感器對(duì)大腸桿菌O157：H7進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示：菌液濃度在2.2×105～2.2×108CFU/mL范圍

3、時(shí)，直接法壓電免疫傳感器的頻率變化與菌液濃度的對(duì)數(shù)值存在線性關(guān)系，回歸方程：y=-6.7 LogN+22.8，決定系數(shù)R2為0.9171。最低檢測(cè)限為2.2×105 CFU/mL。為有效地固定抗體，用循環(huán)伏安研究了MPA不同的修飾時(shí)間。結(jié)果表明：12個(gè)小時(shí)足夠使電極表面鋪滿MPA。石英晶體微天平(QCM)和循環(huán)伏安兩種方法很好地表征了傳感器的制作和檢測(cè)過(guò)程。
　　 (2)探索了檢測(cè)大腸桿菌O157：H7的基于納米金線的壓電免疫傳

4、感器的建立。納米金線通過(guò)1，6-己二硫醇作為中間試劑共價(jià)結(jié)合到電極金表面；采用蛋白A吸附將抗體固定到納米金線上。結(jié)果顯示：在流動(dòng)池中固定納米金線的方法是不可行的；在氣相中浸泡的方式可以將大量的納米金線修飾到電極表面；納米金線溶液中的十六烷基三甲基澳化銨使蛋白A和納米金線的吸附受阻，直接影響到抗體的固定效果；且該表面活性劑無(wú)法清洗干凈；SEM證明了該試劑對(duì)目標(biāo)檢測(cè)信號(hào)造成嚴(yán)重干擾。
　　 (3)建立了基于納米金顆粒(30 nm)制

5、作的壓電免疫傳感器檢測(cè)大腸桿菌O157：H7。采用雙硫醇在金電極表面修飾納米金顆粒，抗體通過(guò)自組裝MHDA膜固定。結(jié)果表明：超級(jí)Piranha試劑清洗QCM金電極對(duì)固定納米金顆粒非常有效；該免疫傳感器對(duì)目標(biāo)菌的響應(yīng)在低濃度時(shí)優(yōu)勢(shì)更明顯；未經(jīng)離心的大腸桿菌O157：H7溶液中的雜質(zhì)能夠引起該免疫傳感器很明顯的非特異性信號(hào)；與控制組對(duì)比，該免疫傳感器的檢測(cè)限降低了一個(gè)數(shù)量級(jí)，且已經(jīng)達(dá)到理論計(jì)算上的最低檢出濃度。SEM驗(yàn)證了納米金顆粒在QCM

6、金電極表面的固定和該免疫傳感器對(duì)大腸桿菌O157：H7的捕捉以及檢測(cè)。
　　 (4)研究了一種基于納米磁珠(30 nm)信號(hào)放大的QCM免疫傳感器對(duì)禽流感病毒H5N1進(jìn)行檢測(cè)。多克隆抗-H5抗體通過(guò)MHDA自組裝膜固定到QCM金電極表面。采用生物素-鏈霉親和素體系在納米磁珠表面修飾抗-H5抗體。研究顯示：D-biotin和BSA聯(lián)用對(duì)納米磁珠表面進(jìn)行封閉時(shí)，納米磁珠的非特異性響應(yīng)最??；納米磁珠對(duì)信號(hào)的放大作用在低滴定度時(shí)更有效；

7、且使檢測(cè)限降低了兩個(gè)數(shù)量級(jí)。在0.128～12.8 HA單位范圍內(nèi)，頻率的變化和禽流感病毒H5N1滴定度的對(duì)數(shù)值呈良好的相關(guān)關(guān)系，回歸方程：△f=-37.67LogN-44.295，決定系數(shù)R2=0.99：最低檢測(cè)限為0.0128 HA單位。在用于咽拭子樣品檢測(cè)中，檢測(cè)下限為0.128 HA單位；在0.128～12.8 HA單位范圍內(nèi)，頻率響應(yīng)和病毒滴定度的對(duì)數(shù)值之間存在線性關(guān)系。回歸方程是△f=-15.835 LogN-23.969，

8、決定系數(shù)R2=0.87。該免疫傳感器對(duì)H5N1檢測(cè)的特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，能夠從其他亞型(H3N2、H2N2、H4N8)中檢測(cè)出H5N1。QCM傳感器的實(shí)時(shí)響應(yīng)圖和ESEM可以很好的表征該免疫傳感器的制作過(guò)程、目標(biāo)捕獲以及納米磁珠對(duì)目標(biāo)信號(hào)的放大。
　　 (5)論證了石英晶體金電極作為工作電極、利用法拉第阻抗譜技術(shù)快速檢測(cè)大腸桿菌O157：H7的無(wú)標(biāo)記型電化學(xué)免疫傳感器的可行性。提出了一個(gè)由電解液的歐姆電阻(Rs)、雙層電容(Cd

9、l)、電子轉(zhuǎn)移電阻(Ret)和Warburg阻抗構(gòu)成的等效電路模擬免疫傳感器的性能。結(jié)果顯示：當(dāng)目標(biāo)菌吸附到電極表面時(shí)，Ret變化最大。在1.6×103～1.6×106CFU/mL范圍內(nèi)，阻抗變化值和濃度的對(duì)數(shù)值成線性關(guān)系：y=244.31 LogN-739.96，決定系數(shù)R2為0.9808。該免疫傳感器的檢測(cè)限是103CFU/mL。電化學(xué)阻抗譜和循環(huán)伏安曲線可以很好地表征電極表面的修飾及免疫反應(yīng)的進(jìn)行。
　　 (6)建立了基于

10、石英晶體金電極的無(wú)標(biāo)記型電容式免疫傳感器用于對(duì)大腸桿菌O157：H7的檢測(cè)。MPA自組裝膜作為媒介將抗體固定到電極表面。試驗(yàn)結(jié)果顯示：雙層電容的變化和大腸桿菌O157：H7的濃度相關(guān)；在102～105CFU/mL范圍時(shí)，雙層電容在1 Hz的變化值和濃度的對(duì)數(shù)值呈線性關(guān)系，回歸方程：y=-41.65 LogN+56.75，決定系數(shù)R2為0.98；等效電路中，雙層電容(Cdl)由Cins、Crec、CGC串聯(lián)構(gòu)成；該電容式免疫傳感器在一個(gè)小