DNA電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建及其生化分析新方法研究.pdf

1、隨著精準(zhǔn)醫(yī)療、基因測(cè)試、法醫(yī)鑒定、環(huán)境檢測(cè)等研究領(lǐng)域的迅速發(fā)展，實(shí)現(xiàn)對(duì)病原蛋白和特定序列DNA的快速、靈敏、簡(jiǎn)單的痕量分析越來(lái)越重要?；贒NA的電化學(xué)生物傳感器由于輕巧便宜、能耗少、靈敏度高和易于微型化等優(yōu)勢(shì)引起了廣泛的關(guān)注，成為當(dāng)今生化分析、轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)等交叉領(lǐng)域的前沿性課題。核酸分子體外等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是分子生物學(xué)領(lǐng)域常用的一種研究方法。DNA電化學(xué)生物傳感器利用電化學(xué)檢測(cè)的高靈敏性，與各種可再生策略和信號(hào)放大策略相結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)痕量靶

2、標(biāo)的靈敏檢測(cè)。本文圍繞DNA電化學(xué)生物傳感器研究的關(guān)鍵問(wèn)題，即如何快速制備穩(wěn)定、高活性的傳感界面，如何構(gòu)建信號(hào)重現(xiàn)、可再生的新型器件、如何進(jìn)行信號(hào)放大實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)高靈敏的檢測(cè)等問(wèn)題，制備了一系列新型DNA電化學(xué)生物傳感器，并將其應(yīng)用于生化分析中。以DNA探針為平臺(tái)，結(jié)合DNA鏈置換反應(yīng)、生物酶催化、聚鳥(niǎo)嘌呤納米線(xiàn)等技術(shù)，在發(fā)展DNA電化學(xué)生物傳感檢測(cè)方面做了以下工作:
　　1.基于低pH和高鹽濃度緩沖用于金固相界面快速組裝單鏈DNA

3、探針
　　實(shí)現(xiàn)單鏈DNA（ssDNA）探針在傳感界面上的快速、穩(wěn)定、簡(jiǎn)單的組裝，可以有力推動(dòng)DNA電化學(xué)傳感器臨床檢測(cè)、現(xiàn)場(chǎng)診斷等方面的實(shí)際應(yīng)用。本章中，利用低pH高鹽濃度方法實(shí)現(xiàn)了ssDNA在金電極表面的快速固定化，探針組裝過(guò)程可以在30分鐘之內(nèi)完成，且不會(huì)影響DNA探針的雜交活性。更深入的探討了固定機(jī)理，通過(guò)電化學(xué)阻抗圖譜計(jì)算出ssDNA探針在電極表面的覆蓋度和反應(yīng)的吉布斯自由能，說(shuō)明低pH高鹽濃度方法是通過(guò)化學(xué)吸附，即共價(jià)鍵

4、結(jié)合的方式將ssDNA固定在金電極表面。pH和鹽濃度均會(huì)影響固定化進(jìn)程，兩者存在協(xié)同作用。這種方法相比于傳統(tǒng)方法（生理pH緩沖）操作更加簡(jiǎn)便、快速，對(duì)不同長(zhǎng)度DNA片段均可以作用，具有較好的普適性。因此，該方法適用于構(gòu)建各種基于DNA的電化學(xué)傳感器，在快速制備DNA傳感芯片等領(lǐng)域有較強(qiáng)的潛在應(yīng)用價(jià)值。
　　2.基于DNA鏈置換反應(yīng)和鎖核酸技術(shù)構(gòu)建可再生DNA電化學(xué)傳感器用于檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性
　　近年來(lái)，單核苷酸多態(tài)性（SN

5、P）的靈敏檢測(cè)一直是基因診斷研究中的重要課題。本章報(bào)道了一種基于鎖核酸修飾技術(shù)和DNA鏈置換反應(yīng)構(gòu)建的可再生電化學(xué)傳感器，并將其用于 p53基因273位點(diǎn)單堿基突變的靈敏檢測(cè)。此類(lèi)傳感器件可以通過(guò)監(jiān)測(cè)電流信號(hào)ON和OFF的狀態(tài)判斷目標(biāo)物存在與否。當(dāng)電流信號(hào)由ON轉(zhuǎn)變?yōu)镺FF時(shí)，電極表面由于目標(biāo)物的存在發(fā)生了DNA鏈置換反應(yīng)。當(dāng)有其他干擾序列存在時(shí)，電流信號(hào)不變，體系依舊保持ON的狀態(tài)。把LNA和SDR技術(shù)引入到檢測(cè)體系中，提高了鏈置換反

6、應(yīng)的速率和傳感器檢測(cè)的效果。此外，本章構(gòu)建的傳感器具有優(yōu)異的選擇性和穩(wěn)定性，在污染緩沖和高倍數(shù)魚(yú)精基因組中仍然可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的檢測(cè)。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)生物酶的參與，不需要復(fù)雜的儀器操作和精密的溫度控制。因此，這個(gè)新設(shè)計(jì)的DNA電化學(xué)傳感器對(duì)于目標(biāo)DNA分子的檢測(cè)不僅具有較好的靈敏度，而且具有優(yōu)異的選擇性和可再生性，在未來(lái)的生物芯片設(shè)計(jì)中具有良好的應(yīng)用前景。
　　3.基于i-motif構(gòu)象轉(zhuǎn)換構(gòu)建可再生DNA電化學(xué)傳感器用于檢測(cè)

7、葡萄糖和尿素
　　以i-motif結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)開(kāi)展了廣泛研究，如拓?fù)湫再|(zhì)、pH傳感、納米機(jī)器等。然而，利用i-motif結(jié)構(gòu)作為傳感器元件，探討在生物檢測(cè)方向的應(yīng)用少有報(bào)道。本章通過(guò)利用富含胞嘧啶的DNA探針在不同pH值下的構(gòu)象轉(zhuǎn)變，發(fā)展了一種新型簡(jiǎn)單且無(wú)標(biāo)記的電化學(xué)方法，用于檢測(cè)葡萄糖和尿素。通過(guò)葡萄糖氧化酶和脲酶的生物催化反應(yīng)實(shí)現(xiàn)反應(yīng)溶液pH值的調(diào)節(jié)，進(jìn)而調(diào)節(jié)富含胞嘧啶的DNA探針在單鏈構(gòu)象和i-motif構(gòu)象之間的轉(zhuǎn)變。通過(guò)電

8、化學(xué)阻抗的方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)構(gòu)象轉(zhuǎn)變的表征，利用電化學(xué)阻抗值的變化可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物葡萄糖和尿素的檢測(cè)。由于酶催化的優(yōu)異特異性，使此傳感器具有較高的選擇性，其他生物分子干擾物不影響目標(biāo)物的檢測(cè)。此外，此傳感器還具有較高的可再生性能和穩(wěn)定性，具有較強(qiáng)的潛在應(yīng)用價(jià)值。
　　4.基于聚鳥(niǎo)嘌呤納米線(xiàn)信號(hào)放大靈敏檢測(cè)核酸片段
　　近年來(lái)，許多信號(hào)放大測(cè)試策略已被報(bào)道用于構(gòu)建靈敏的電學(xué)、光學(xué)等傳感平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸、蛋白等生物分子的檢測(cè)。但大多

9、數(shù)檢測(cè)方法具有貴重的溫控儀器、復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)步驟、耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)。因此，開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)便易行、快速靈敏的新型信號(hào)放大策略具有十分重要的意義。本章中利用富含G堿基的c-myc DNA序列，在鉀離子存在下形成具有TMB催化活性的G-四鏈體，繼續(xù)加入鎂離子后形成一系列具有TMB催化活性的聚鳥(niǎo)嘌呤納米線(xiàn)（G-wire）。我們將此現(xiàn)象作為信號(hào)放大方式應(yīng)用于金電極上靈敏檢測(cè)DNA片段。把巰基修飾的c-myc序列連接在金電極上，加入游離的c-myc序列和鎂離子，利

10、用計(jì)時(shí)電流法和電化學(xué)阻抗法均檢測(cè)到TMB催化信號(hào)的增強(qiáng)。隨后，利用目標(biāo)DNA打開(kāi)發(fā)卡結(jié)構(gòu)探針，使c-myc序列暴露，形成G-wire后進(jìn)行信號(hào)放大檢測(cè)，最低可檢出15 pM。此方法不需要生物酶的參與，避免了復(fù)雜的溫控過(guò)程，可以在室溫下進(jìn)行。與其他方法相比，該方法在靈敏度、線(xiàn)性范圍上具有優(yōu)點(diǎn)，有望滿(mǎn)足基本的復(fù)雜樣品檢測(cè)需求。
　　5.基于聚鳥(niǎo)嘌呤納米線(xiàn)信號(hào)放大靈敏檢測(cè)凝血酶
　　凝血酶的活性及含量可以作為衡量凝血機(jī)制的關(guān)鍵指標(biāo)

11、之一，它對(duì)相關(guān)疾病的早期診斷、治療及愈后判斷具有非常重大的意義。建立快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、高靈敏的分析檢測(cè)策略和傳感裝置用于凝血酶的定量分析在化學(xué)、生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中十分必要。本章以聚鳥(niǎo)嘌呤納米線(xiàn)為信號(hào)放大結(jié)構(gòu)構(gòu)筑了免標(biāo)記型的電化學(xué)傳感器用于靈敏檢測(cè)凝血酶。目標(biāo)蛋白凝血酶可以與電極上的適配體和溶液中的L-DNA同時(shí)結(jié)合形成夾心結(jié)構(gòu)，將L-DNA組裝到電極上，在游離的c-myc和鎂離子的存在下引發(fā)G-wire的生成。在測(cè)試底液TMB和H2O2

12、中，聚鳥(niǎo)嘌呤納米線(xiàn)與hemin結(jié)合形成具有TMB催化功能的DNA酶串聯(lián)體，對(duì)TMB的催化反應(yīng)電流起到了明顯的增強(qiáng)作用，從而有效地提高了電極靈敏度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該電化學(xué)適體傳感器制備方法簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好、具有較高的選擇性和靈敏度，將其用于臨床模擬樣品的分析檢測(cè)得到了令人滿(mǎn)意的結(jié)果。
　　6.聚腎上腺素?zé)晒庥袡C(jī)量子點(diǎn)的合成及其重金屬離子檢測(cè)應(yīng)用
　　熒光有機(jī)納米材料因具有低毒、較好的生物相容性、功能性可調(diào)等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為在生物成像