Cd2抗體與抗原結合的特性及介導的效應研究.pdf

1、CD28分子的基因定位于人2號染色體q33-34區(qū)，由1120核苷酸組成，表達于大多數靜止及活化的T細胞，約95％CD4+T和50％CD8+T細胞表達該分子。此外，部分NK細胞和人惡性漿細胞也表達CD28分子。B7-1(CD80)和B7-2(CD86)是CD28的天然配體，CD28分子與表達在抗原呈遞細胞表面的相應配體B7-1和B7-2結合，從而產生T細胞應答所需的協(xié)同刺激信號。B7-CD28信號并非僅局限性地產生于抗原呈遞細胞與T細胞

2、之間，已在某些腫瘤細胞如多發(fā)性骨髓瘤細胞，白血病細胞等也發(fā)現異常的B7-CD28信號通路，且該通路可能參與腫瘤的惡性增殖與轉移。通過特異性抗體封閉CD28分子，有可能對腫瘤細胞的生長發(fā)揮抑制作用。本研究旨在運用自行制備的CD28抗體，以轉染人CD28基因的小鼠T淋巴瘤細胞株及天然表達CD28分子的人白血病細胞株Jurkat為研究對象，在體外分析抗體對上述細胞生長與增殖影響的基礎上，通過建立腫瘤模型，探討抗體對腫瘤細胞的成瘤及腫瘤消長的影

3、響，以期尋找具有抗瘤作用的生物制劑。
　　 第一部分鼠抗人CD28分子單克隆抗體的制備及鑒定
　　 目的：制備鼠抗人CD28分子單克隆抗體并鑒定其生物學功能。
　　 方法：采用本室建立的腹水誘生法制備單抗并經Protein G親和層析分離純化。間接免疫熒光法分析單克隆抗體效價；FCM分析單克隆抗體識別的抗原位點；FCM分析單克隆抗體對不同細胞株人多發(fā)性骨髓瘤細胞(U266)、小鼠淋巴瘤細胞轉入CD28基因細胞株(

4、CD28-T)和人白血病細胞株(Jurkat)膜型CD28分子的識別。
　　 結果：腹水形成率為90％以上，收獲量為5ml/只以上。腹水中抗體蛋白的得率達3mg/ml。純化抗體用于間接免疫熒光檢測的用量為0.5μg/5×105。競爭抑制試驗表明該單抗能完全阻斷標準鼠抗人CD28抗體與相應抗原的結合，提示其識別的抗原表位與對照抗體相同或相似。FCM分析表明，CD28 mAb能良好地識別多種細胞表面膜型CD28分子。
　　

5、結論：制備了鼠抗人CD28分子mAb(命名為SQA-11)，為探討CD28信號轉導在腫瘤生長與轉移過程中的作用及機制奠定了物質基礎。
　　 第二部分 SQA-11與腫瘤細胞膜型CD28結合后介導的效應研究
　　 目的：探討SQA-11體內、外對CD28+腫瘤細胞的生長與增殖的影響作用，以期尋找具有抗瘤作用的生物制劑。
　　 方法：MTT法體外分析SQA-11對CD28-T和Jurkat生長和增殖的影響；建立CD2

6、8-T與Jurkat細胞的Balb/c裸鼠的腫瘤模型，FCM分析成瘤小鼠瘤體細胞CD28分子的表達；將CD28-T與Jurkat分別經SQA-11預處理后再行建立腫瘤模型，觀察成瘤時間和成瘤率，同時與未經抗體處理組進行比較。將腫瘤模型隨機分組，采用瘤內注射法將SQA-11分2-3點、隔日一次共4次注入瘤內，抗體用量為50μg/mm3觀察腫瘤的消長及荷瘤鼠的生存狀態(tài)。
　　 結果：MTT檢測發(fā)現SQA-11能夠明顯抑制CD28-T

7、和Jurkat細胞的體外增殖。CD28-T細胞于接種第3天即形成肉眼可見的腫瘤結節(jié)，且成瘤率為100％(40/40)。Jurkat細胞于接種第14天后陸續(xù)形成肉眼可見的腫瘤結節(jié)，成瘤率為80％(32/40)。對接種第40天的腫瘤結節(jié)中的細胞經FCM進行分析，CD28的陽性率分別為CD28-T90.4％、Jurkat74.3％。與未接種前體外培養(yǎng)的細胞無明顯差異。CD28-T與Jurkat細胞分別經SQA-11共孵育后接種小鼠，CD28-

8、T的成瘤時間推遲2天即第5天形成肉眼可見的腫瘤結節(jié)，成瘤率仍為100％(20/20)；Jurkat細胞的成瘤時間推遲5天即第19天開始形成腫瘤結節(jié)，成瘤率為50％(10/20)。將CD28-T(第7天)及Jurkat(第30天)腫瘤模型用SQA-11瘤內注射，觀察40天。Jurkat模型組部分(3/10)裸鼠的腫瘤結節(jié)變小，平均體積由注射時的56mm3減為32mm3；對CD28-T模型組腫瘤結節(jié)的生長無抑制作用。
　　 結論：S