特異性抗體與慢病毒介導(dǎo)RNAi抑制B7-CD28協(xié)同刺激信號(hào)對(duì)小鼠狼瘡樣腎炎的免疫干預(yù)效應(yīng)及分子機(jī)制研究.pdf

1、B7分子表達(dá)在抗原遞呈細(xì)胞(antigen-presenting cell,APC)的表面，是重要的T細(xì)胞協(xié)同刺激分子，正常生理?xiàng)l件下，其與T細(xì)胞表面的CD28結(jié)合及傳遞適度的B7/CD28信號(hào)是啟動(dòng)T細(xì)胞免疫應(yīng)答以及促進(jìn)T細(xì)胞依賴的B細(xì)胞活化和功能發(fā)揮所必需的。在病理狀態(tài)下，B7/CD28信號(hào)活化過度，致使T、B細(xì)胞功能亢進(jìn)和異常免疫應(yīng)答，從而導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生。
　　系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus eryt

2、hematosus,SLE)是一種慢性的自身免疫性疾病，患者機(jī)體免疫功能出現(xiàn)紊亂：T、B細(xì)胞等發(fā)生異常的免疫應(yīng)答，促進(jìn)多種自身抗體形成，進(jìn)而出現(xiàn)免疫復(fù)合物在各種組織器官的沉積以及不可逆轉(zhuǎn)性的炎癥損傷。在SLE眾多病理表現(xiàn)中，狼瘡性腎炎(lupus nephritis,LN)最為常見，亦是嚴(yán)重威脅患者生命的主要并發(fā)癥，尤其受到關(guān)注。研究表明，在LN的病理過程中B7/CD28協(xié)同刺激信號(hào)參與其中，該信號(hào)通路的過度活化及導(dǎo)致的T、B細(xì)胞功能亢

3、進(jìn)對(duì)于LN的發(fā)生發(fā)展具有重要的作用。
　　通過特異性抗體結(jié)合及封閉B7分子在蛋白水平干預(yù)B7/CD28信號(hào)通路，可中斷或者削弱T、B細(xì)胞的異常免疫應(yīng)答以及恢復(fù)機(jī)體正常的免疫耐受，對(duì)于減輕SLE的病理?yè)p傷具有積極的意義。同樣的，采用RNA干擾(RNA interference,RNAi)的方式在基因水平上特異性的沉默B7基因，進(jìn)而使得APC表面缺失或下調(diào)B7分子，也可以達(dá)到對(duì)B7/CD28協(xié)同刺激信號(hào)阻斷或者抑制的目的，從而使T、B

4、細(xì)胞等異常的活化與應(yīng)答得到控制。
　　本研究采用本科室前期所建立的分泌小鼠抗人B7-2單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，自行生產(chǎn)制備B7-2分子特異性抗體并對(duì)其進(jìn)行體外生物學(xué)特性的鑒定，同時(shí)構(gòu)建小鼠B7-2基因RNAi重組慢病毒并分析驗(yàn)證其對(duì)B7/CD28協(xié)同刺激信號(hào)的拮抗效應(yīng)。與此同時(shí)，建立降植烷(Pristane)誘導(dǎo)的，與人類狼瘡病理過程/癥狀類似的C57BL/6小鼠狼瘡樣腎炎模型，通過免疫細(xì)胞活化、自身抗體產(chǎn)生與免疫復(fù)合物沉積以及

5、腎臟炎癥損傷等指標(biāo)檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷姆€(wěn)定可靠性。在前述基礎(chǔ)之上，采用B7-2特異性抗體在蛋白水平及小鼠B7-2基因RNAi重組慢病毒在基因水平抑制B7/CD28協(xié)同刺激信號(hào)、影響SLE病理過程中APC-T細(xì)胞-B細(xì)胞的病理性連鎖反應(yīng)軸，對(duì)C57BL/6小鼠狼瘡樣腎炎模型實(shí)施整體免疫干預(yù)，通過免疫學(xué)、血清學(xué)及組織病理學(xué)等指標(biāo)的動(dòng)態(tài)檢測(cè)與分析，探究對(duì)小鼠狼瘡樣腎炎形成和病理?yè)p傷的免疫干預(yù)效應(yīng)以及相應(yīng)的分子機(jī)制，同時(shí)對(duì)不同干預(yù)方式對(duì)狼瘡小鼠腎臟病理?yè)p

6、傷的緩解/逆轉(zhuǎn)效應(yīng)進(jìn)行比較，以期為SLE疾病發(fā)生發(fā)展中免疫細(xì)胞活化及病理?yè)p傷的演變過程提供新的證據(jù)，同時(shí)為此類疾病尋找新的生物學(xué)干預(yù)手段。
　　第一部分小鼠抗人B7-2分子功能性單克隆抗體的制備及生物學(xué)特性研究
　　目的：制備小鼠抗人B7-2分子功能性單克隆抗體，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行研究。
　　方法：運(yùn)用小鼠抗人B7-2單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，采用誘生腹水法制備抗體；Protein G免疫親和層析法純化抗體；流式細(xì)胞

7、術(shù)檢測(cè)該抗體對(duì)不同種類細(xì)胞的膜型B7-2分子的識(shí)別能力；MTT法檢測(cè)其對(duì)B7/CD28協(xié)同刺激信號(hào)的拮抗作用。
　　結(jié)果：通過誘生腹水法進(jìn)行抗體制備時(shí)腹水形成的陽(yáng)性率約為80％，腹水的平均收獲量為5.5mL/只小鼠，抗體蛋白的得率平均為2.5mg/mL腹水；該抗體能夠識(shí)別L929-B7-2、Raji及小鼠脾臟細(xì)胞表面的B7-2分子，陽(yáng)性結(jié)合率分別為94.5%、98.2%及52.7%；同時(shí)此抗體也能夠拮抗B7-2介導(dǎo)的協(xié)同刺激信號(hào)以

8、及顯著抑制L929-B7-2刺激人外周血淋巴細(xì)胞的增殖效應(yīng)(p＜0.05)。
　　結(jié)論：成功制備了B7-2分子特異性單克隆抗體，該抗體能夠有效拮抗B7/CD28協(xié)同刺激信號(hào)。
　　第二部分小鼠B7-2基因RNAi慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及重組慢病毒的制備
　　目的：構(gòu)建小鼠B7-2基因RNA干擾慢病毒表達(dá)載體，并進(jìn)行重組慢病毒的制備。
　　方法：選擇三段小鼠B7-2基因RNAi的靶序列，設(shè)計(jì)合成短發(fā)夾RNA的模板，將

9、其克隆導(dǎo)入慢病毒表達(dá)載體，將篩選及鑒定的表達(dá)載體與慢病毒包裝及包膜質(zhì)粒通過脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，從而包裝生產(chǎn)重組慢病毒；重組慢病毒通過超速離心法進(jìn)行濃縮；采用細(xì)胞生物學(xué)的方法進(jìn)行滴度測(cè)定以及及復(fù)制型慢病毒的檢測(cè)。
　　結(jié)果：經(jīng)測(cè)序鑒定，重組小鼠B7-2基因RNAi慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建正確；通過慢病毒質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝制備了重組慢病毒；經(jīng)超速離心獲得了濃縮的慢病毒顆粒，經(jīng)細(xì)胞生物學(xué)方法檢測(cè)證實(shí)，病毒滴度達(dá)到1～3×108

10、TU/mL，同時(shí)在重組慢病毒感染過程中無(wú)復(fù)制型病毒的產(chǎn)生，具有良好的生物安全性。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建了分別針對(duì)三個(gè)不同靶點(diǎn)的小鼠B7-2基因RNAi重組慢病毒表達(dá)載體，并包裝制備了具有良好生物安全性的高滴度重組慢病毒(LV-139/LV-425/LV-848)。
　　第三部分小鼠B7-2基因RNAi重組慢病毒對(duì)樹突狀細(xì)胞膜型B7-2分子表達(dá)的干擾效應(yīng)研究
　　目的：依據(jù)對(duì)DC膜型B7-2表達(dá)干擾效應(yīng)的差異，篩選出基因沉

11、默效果最佳的重組小鼠B7-2基因RNAi慢病毒，并檢測(cè)其對(duì)B7/CD28協(xié)同刺激信號(hào)的拮抗作用。
　　方法：從C57BL/6小鼠中分離獲得骨髓細(xì)胞，采用細(xì)胞因子(GM-CSF及IL-4)誘生法制備DC，應(yīng)用脂多糖刺激48h促進(jìn)成熟，同時(shí)通過對(duì)其生長(zhǎng)形態(tài)、表面分子表達(dá)(CD11c、B7-1、B7-2及MHCⅡ)的檢測(cè)進(jìn)行鑒定；重組慢病毒LV-NC以不同感染復(fù)數(shù)(5,10,20,40,60)感染體外分離誘導(dǎo)的DC后，采用流式細(xì)胞術(shù)分析

12、感染效率并確定最佳的感染條件；重組慢病毒LV-139、LV-425及LV-848以確定的感染條件感染DC，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其對(duì)DC膜型B7-2分子表達(dá)的干擾效率并確定具有最佳干擾效果的小鼠B7-2基因RNAi重組慢病毒；MTT法測(cè)定小鼠B7-2基因RNAi重組慢病毒對(duì)B7/CD28協(xié)同刺激信號(hào)的拮抗作用和對(duì)DC刺激小鼠脾臟T細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)。
　　結(jié)果：成功分離誘導(dǎo)出小鼠骨髓源DC，其具有典型的樹突狀突起、表達(dá)CD11c(68.5

13、%)及B7-1(71.6%)、B7-2(74.0%)、MHCⅡ(84.0%)；經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析，重組慢病毒LV-NC可以有效感染DC，感染效率達(dá)到86.4%；重組慢病毒LV-139、LV-425、LV-848在感染復(fù)數(shù)為80時(shí)，對(duì)DC膜型B7-2分子表達(dá)的干擾效率分別為66.7%、67.2%及63.8%；經(jīng)MTT法檢測(cè)，重組慢病毒LV-425能夠拮抗B7-2介導(dǎo)的協(xié)同刺激信號(hào)以及顯著抑制DC刺激小鼠脾臟T細(xì)胞的增殖效應(yīng)(p＜0.05)。

14、
　　結(jié)論：小鼠B7-2基因RNAi重組慢病毒LV-425可有效拮抗B7/CD28協(xié)同刺激信號(hào)。
　　第四部分小鼠狼瘡樣腎炎模型的建立及生物學(xué)鑒定
　　目的：建立降植烷(Pristane)誘導(dǎo)的小鼠狼瘡樣腎炎模型，并對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)鑒定。
　　方法：C57BL/6小鼠(雌性，6～8周齡)經(jīng)腹腔一次性注射Pristane0.5mL/只進(jìn)行模型的制備。建模后第10天，流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠脾臟中Mφ、DC、粒細(xì)胞及B細(xì)胞活

15、化狀況以及B細(xì)胞表面B7-2、MHCⅡ的表達(dá)情況；每個(gè)月進(jìn)行眼眶經(jīng)脈叢定期活體取血以及血清中ANA及抗dsDNA抗體表達(dá)的間接免疫熒光分析；每月一次早晨收集小鼠新鮮尿液，應(yīng)用Albustix試紙測(cè)定尿蛋白含量；建模后的第8個(gè)月時(shí)，直接免疫熒光法分析免疫復(fù)合物在腎臟中沉積的情況，HE染色檢查腎臟病理?yè)p傷的狀況。
　　結(jié)果：
　　1.建模后第10天，小鼠脾臟中CD11b+細(xì)胞(Mφ)、CD11c+細(xì)胞(DC)、Gr1+(粒細(xì)胞)

16、以及CD21+細(xì)胞(B細(xì)胞)活化程度均出現(xiàn)上調(diào)，陽(yáng)性率分別為7.35±0.60%3.78±0.26%、9.85±0.73%及20.94±1.24%，顯著高于正常對(duì)照組(p＜0.05)；CD21+B細(xì)胞表面 B7-2以及 MHCⅡ的表達(dá)率也出現(xiàn)升高，分別為48.31±2.24%和67.15±3.62%，與對(duì)照組差異顯著(p＜0.05)。
　　2.建模組部分小鼠3個(gè)月時(shí)血清中ANA和dsDNA出現(xiàn)陽(yáng)性(陽(yáng)性率：30%和10%)，其陽(yáng)性

17、率和抗體滴度隨著時(shí)間的推移而逐漸增加；至8個(gè)月時(shí)，模型組ANA檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，dsDNA抗體的陽(yáng)性率達(dá)89%。
　　3.Pristane注射4個(gè)月后，30%的小鼠開始檢測(cè)到蛋白尿的出現(xiàn)，尿蛋白含量在0.3～3g/L(+～++)之間，蛋白尿的陽(yáng)性率和尿蛋白含量隨時(shí)間推移而逐漸增加，監(jiān)測(cè)至第8個(gè)月，全部的建模組小鼠蛋白尿陽(yáng)性，尿蛋白含量在1～2g/L(++～++++)之間。
　　4.經(jīng)直接免疫熒光檢測(cè)，8個(gè)月時(shí)，建模組小鼠腎臟

18、中腎小球毛細(xì)血管、系膜區(qū)等處出現(xiàn)明顯的免疫復(fù)合物沉積；HE染色以及組織病理學(xué)檢查顯示，模型小鼠腎小球體積增大，腎小球內(nèi)及系膜區(qū)淋巴細(xì)胞侵潤(rùn)，部分腎小球血管袢變性壞死，腎小球囊腔增大。
　　結(jié)論：建立了與人類狼瘡表現(xiàn)類似的Pristane誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠狼瘡樣腎炎模型。
　　第五部分B7-2分子特異性抗體及RNAi重組慢病毒對(duì)小鼠狼瘡樣腎炎的免疫干預(yù)效應(yīng)及分子機(jī)制研究
　　目的：運(yùn)用B7-2單克隆抗體和小鼠B7-

19、2基因RNAi重組慢病毒抑制B7/CD28協(xié)同刺激信號(hào)，研究及比較不同方式對(duì)小鼠狼瘡樣腎炎模型的形成及病理?yè)p傷的免疫干預(yù)效應(yīng)并探究其分子機(jī)制。
　　方法：B7-2抗體早期干預(yù)組：在給予一次性腹腔注射0.5mL Pristane后，每只小鼠分別于第1、3、5、8、15天尾靜脈注射200μg B7-2單克隆抗體，隨后的3個(gè)月內(nèi)每隔1個(gè)月注射一次；延遲B7-2抗體干預(yù)組：在建模4個(gè)月后，直到小鼠出現(xiàn)蛋白尿以及自身抗體時(shí)給予B7-2抗體進(jìn)

20、行干預(yù)，給藥方式及劑量與早期B7-2抗體干預(yù)組相同；重組小鼠B7-2基因RNAi慢病毒干預(yù)組：每只小鼠分別于第1天和第60天尾靜脈注射0.5×108 TU重組慢病毒LV-425；同時(shí)設(shè)立正常對(duì)照、同型抗體對(duì)照、化學(xué)藥物(環(huán)磷酰胺，CTX)對(duì)照及重組慢病毒LV-NC對(duì)照。Pristane注射10天后流式細(xì)胞術(shù)分析LV-425對(duì)小鼠脾臟APC表面B7-2分子表達(dá)的干擾效應(yīng)，同時(shí)檢測(cè)各組小鼠脾臟中巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、粒細(xì)胞以及B細(xì)胞的活化情

21、況；通過間接免疫熒光法和Albustix試紙法監(jiān)測(cè)小鼠血清自身抗體(ANA和抗dsDNA抗體)的表達(dá)水平及蛋白尿產(chǎn)生的情況；運(yùn)用ELISA法檢測(cè)小鼠血清中IFN-γ及IL-4的含量，直接免疫熒光法分析小鼠腎臟中免疫復(fù)合物沉積的狀況，；直接免疫熒光法分析免疫復(fù)合物在小鼠腎臟中沉積的狀況，并通過光鏡及透射電鏡進(jìn)行小鼠腎臟病理學(xué)檢查。
　　結(jié)果：
　　1.小鼠B7-2基因RNAi重組慢病毒給藥后，脾臟中Mφ(CD11b+)、DC(

22、CD11c+)及B細(xì)胞(CD21+)膜型B7-2表達(dá)率顯著低于建模組(p＜0.05)。
　　2.運(yùn)用B7-2抗體和小鼠B7-2基因RNAi重組慢病毒LV-425早期干預(yù)后，小鼠脾臟APC的活化程度較建模組顯著降低(p＜0.05)。
　　3. B7-2單克隆抗體與重組慢病毒LV-425早期干預(yù)抑制了小鼠ANA及抗dsDNA抗體的表達(dá)：3個(gè)月時(shí)ANA及抗dsDNA抗體均呈陰性，各干預(yù)組與建模組相比ANA及抗dsDNA抗體8個(gè)月時(shí)

23、的陽(yáng)性率和滴度均呈現(xiàn)顯著的下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)，且B7-2抗體早期干預(yù)組與重組慢病毒LV-425干預(yù)組及B7-2抗體延遲干預(yù)組之間也有顯著性差異(p＜0.05)。
　　4.第8個(gè)月時(shí)B7-2抗體干預(yù)組與LV-425干預(yù)組小鼠血清中IFN-γ及IL-4的含量與建模組相比均出現(xiàn)下降，差異具有顯著性(p＜0.05)。
　　5.B7-2抗體干預(yù)組及小鼠B7-2基因RNAi重組慢病毒干預(yù)組小鼠蛋白尿程度減輕：8個(gè)月

24、時(shí)，B7-2抗體早期干預(yù)及延遲干預(yù)組、重組慢病毒LV-425干預(yù)組小鼠的尿蛋白含量均顯著低于建模組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)；B7-2抗體早期干預(yù)組小鼠蛋白尿的程度以及陽(yáng)性率低于LV-425干預(yù)組及B7-2抗體延遲干預(yù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　6.B7-2抗體早期干預(yù)LV-425干預(yù)及B7-2抗體延遲干預(yù)均使小鼠腎臟免疫復(fù)合物沉積不同程度減少，同時(shí)也減輕了小鼠腎小球炎癥損傷和壞死的程度，各組中B7-2