B7-1單克隆抗體對(duì)小鼠狼瘡樣腎炎模型的免疫干預(yù)效應(yīng)及分子機(jī)制研究.pdf

1、B7-1是表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell, APC)表面的重要協(xié)同刺激分子，其相應(yīng)的受體是表達(dá)在T細(xì)胞表面的CD28家族分子。B7-1與CD28結(jié)合是介導(dǎo) T細(xì)胞活化、增殖、分化及發(fā)揮免疫效應(yīng)所必需的協(xié)同刺激信號(hào)。若缺乏該信號(hào)，T細(xì)胞將進(jìn)入無(wú)反應(yīng)狀態(tài)（Anergy）或免疫耐受（Tolerance）甚至引起程序性死亡（Apoptosis）。
　　自身免疫性疾?。╝utoimmune disease

2、，AID）是自身反應(yīng)T、B細(xì)胞過(guò)度活化，產(chǎn)生大量自身抗體，進(jìn)而導(dǎo)致多系統(tǒng)、多器官受損的一類(lèi)嚴(yán)重疾病。系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是其典型代表。目前研究發(fā)現(xiàn)，B7-CD28協(xié)同刺激信號(hào)參與了SLE的發(fā)生發(fā)展，阻斷或削弱該信號(hào)，可減輕此類(lèi)疾患的病理?yè)p傷。通過(guò)建立動(dòng)物疾病模型模擬人類(lèi)疾病的發(fā)生過(guò)程及臨床表現(xiàn)是研究疾病發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸及尋找新的診治途徑的重要手段。本課題在建立慢性移植物抗宿主

3、?。╟GVHD）小鼠狼瘡樣腎炎模型并對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上，運(yùn)用自行研制的B7-1單克隆抗體對(duì)疾病模型進(jìn)行干預(yù)。通過(guò)免疫學(xué)、血清學(xué)及腎臟病理?yè)p傷評(píng)價(jià)等指標(biāo)考察抗體對(duì)疾病模型的逆轉(zhuǎn)效應(yīng)及分子機(jī)制。以期尋找新的對(duì)SLE及相關(guān)疾患具有防治作用的特異、高效、低毒的生物制劑。
　　一、B7-1單克隆抗體的制備及鑒定
　　目的：制備鼠抗人B7-1單克隆抗體并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定。方法：采用體內(nèi)誘生腹水法制備單抗；Protein G

4、免疫親和層析法純化抗體；流式細(xì)胞術(shù)分析單抗對(duì)人及小鼠細(xì)胞膜型B7-1分子抗原表位的識(shí)別。結(jié)果：經(jīng)體內(nèi)誘生腹水法制備單抗，小鼠腹水形成陽(yáng)性率約為80%，腹水收獲量平均為3.5ml/只小鼠；經(jīng)免疫親和層析法純化，腹水中抗體蛋白的得率為3.2mg/ml；B7-1單克隆抗體與轉(zhuǎn)人B7-1基因小鼠成纖維細(xì)胞株L929-B7-1以及小鼠脾臟細(xì)胞的陽(yáng)性結(jié)合率分別為99.3%及65.4%。結(jié)論：B7-1單克隆抗體能夠特異性識(shí)別相應(yīng)的抗原分子。
　

5、　二、慢性移植物抗宿主病小鼠狼瘡樣腎炎模型的建立及生物學(xué)鑒定
　　目的：構(gòu)建慢性移植物抗宿主病（cGVHD）小鼠狼瘡樣腎炎模型并對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)鑒定。方法：將8周齡雌性(C57BL/6×BALB/c) F1小鼠隨機(jī)分為2組，造模組于0、3、7和11 d經(jīng)尾靜脈注射親代雌性BALB/ c小鼠脾臟細(xì)胞107/100μL/只。正常對(duì)照組給予等量生理鹽水。末次注射后第7天，免疫熒光及流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠脾臟中巨噬細(xì)胞（CD11b+）、樹(shù)突狀細(xì)

6、胞（CD11c+）、中性粒細(xì)胞（Gr1+）及抗體產(chǎn)生細(xì)胞（CD21+等）的陽(yáng)性百分率；每2周定期檢測(cè)血清中抗雙鏈 DNA抗體(ds-DNA)、抗核抗體( ANA)含量；每月定期檢測(cè)尿蛋白含量。3個(gè)月后處死小鼠，經(jīng) HE染色觀(guān)測(cè)腎臟病理變化，石蠟切片直接免疫熒光法分析免疫復(fù)合物（IC）的沉積以及透射電鏡觀(guān)察腎小球超微結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果：造模組小鼠脾臟中CD11b+、CD11c+及Gr1+細(xì)胞的百分率較對(duì)照組明顯升高（p<0.05），同時(shí) B

7、細(xì)胞協(xié)同刺激分子 CD21+、CD23+、CD80+及 CD86+的表達(dá)上調(diào)明顯（p<0.05）；建模2周，70%的小鼠血清中可檢測(cè)到抗dsDNA抗體和ANA，4周時(shí)達(dá)90%；建模3個(gè)月，70%的小鼠出現(xiàn)蛋白尿，蛋白含量為++~++++；HE染色及鏡下觀(guān)察，出現(xiàn)腎小球腫脹及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；直接免疫熒光法呈現(xiàn)大量IC沉積；透射電鏡下可見(jiàn)造模組小鼠腎基底膜節(jié)段性增厚等病理改變。結(jié)論：成功建立慢性移植物抗宿主病小鼠狼瘡樣腎炎模型。
　　三

8、、B7-1單克隆抗體對(duì)小鼠狼瘡樣腎炎的免疫干預(yù)效應(yīng)及分子機(jī)制研究
　　目的：探討B(tài)7-1單克隆抗體通過(guò)阻斷B7-1/CD28信號(hào)通路對(duì)狼瘡樣腎炎模型的免疫干預(yù)效應(yīng)及其分子機(jī)制。方法：按上述建模方法，取F1代小鼠隨機(jī)分為3組，即造模組、抗體干預(yù)組及對(duì)照組。每組15只。干預(yù)組在末次注射淋巴細(xì)胞后第1、3、5、8及15d分別尾靜脈注射B7-1抗體(克隆4E5)200μg/只，然后每月再注射1次，連續(xù)注射2次。造模組同一時(shí)間給予等劑量的I

9、g同型對(duì)照。按照上述時(shí)間點(diǎn)分析脾臟中巨噬細(xì)胞（CD11b+）、樹(shù)突狀細(xì)胞（CD11c+）、中性粒細(xì)胞（Gr1+）及抗體產(chǎn)生細(xì)胞（CD21+等）的陽(yáng)性百分率，抗雙鏈DNA抗體(ds-DNA)、抗核抗體( ANA)含量，尿蛋白含量，免疫復(fù)合物（IC），腎小球超微結(jié)構(gòu)等指標(biāo)。結(jié)果：免疫熒光及流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，抗體干預(yù)組小鼠脾臟細(xì)胞CD11b+、CD11c+及GR1+等分子的表達(dá)及脾臟B細(xì)胞CD21+、CD23+、CD80+及CD86+等

10、分子的表達(dá)均低于造模組（p<0.05）；4周后，造模組90%的小鼠血清能檢測(cè)到抗dsDNA抗體和ANA的表達(dá)，而抗體干預(yù)組僅40%出現(xiàn)陽(yáng)性，且抗體滴度明顯低于造模組（p<0.05）；3個(gè)月時(shí)70%的造模組小鼠出現(xiàn)蛋白尿，蛋白含量為++~++++，抗體干預(yù)組僅有20%，且蛋白含量為+~++； HE染色后鏡下觀(guān)察，造模組腎臟組織出現(xiàn)腎小球腫脹，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)等典型的炎性改變，但抗體干預(yù)組僅部分出現(xiàn)腎小球體積輕度增大，少許淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，毛細(xì)血管