B7-2單克隆抗體對狼瘡樣腎炎小鼠模型的免疫干預效應及分子機制研究.pdf

1、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是一種由自身反應性免疫細胞異?；罨螽a(chǎn)生自身抗體為特征的疾病。病變可累及全身,造成關節(jié)、皮膚、腎臟、心臟、肺、血管等各臟器和組織不可逆的慢性破壞和功能喪失。其中狼瘡性腎炎(lupus nephritis,LN)是SLE最常見也是最嚴重的并發(fā)癥,是導致患者死亡的主要原因。該病的病因至今尚無明確定論,可能與遺傳及環(huán)境等多種因素有關。B7-2分子屬于免疫球蛋白超

2、家族成員之一,是抗原遞呈細胞(antigen present-ing cell, APC)表面重要的協(xié)同刺激分子。其與表達于T細胞表面的CD28結合,介導 T細胞活化、增殖、分化及發(fā)揮免疫效應。缺乏該信號,T細胞將進入無反應狀態(tài)(Anergy)或免疫耐受(Tolerance)甚至引起程序性細胞死亡(Apoptosis)。研究發(fā)現(xiàn),B7-CD28協(xié)同刺激信號參與了SLE的發(fā)生發(fā)展,并發(fā)揮著重要的作用。B7分子的特異性抗體可阻斷或削弱B7-

3、CD28信號,從而抑制免疫應答,因此通過應用B7-2抗體阻斷或削弱B7-CD28通路有望為SLE提供新的生物治療方法。本課題通過建立與人類SLE疾病相似的慢性移植物抗宿主病(cGVHD)狼瘡樣腎炎小鼠模型。運用自行研制的B7-2單克隆抗體對疾病模型進行干預,從免疫學,血清學,腎臟組織形態(tài)學等方面的指標來考察抗體對疾病模型的逆轉效應及可能的分子機制。本研究分為三個部分：
　　第一部分：B7-2單克隆抗體的制備及鑒定。
　　目的

4、：制備B7-2單克隆抗體并對其進行生物學特性鑒定。
　　方法：應用本科室成功建立的穩(wěn)定分泌B7-2單克隆抗體的雜交瘤細胞株1D1,采用體內誘生腹水法制備單抗;Protein G免疫親和層析法純化抗體;流式細胞術分析單抗對不同細胞膜型 B7-2分子的識別。
　　結果：經(jīng)體內誘生腹水法制備 B7-2單抗,小鼠腹水形成陽性率約為80％,腹水收獲量平均為3ml/只小鼠;經(jīng)免疫親和層析法純化,腹水中抗體蛋白的得率為3mg/ml;單抗與

5、轉人B7-2基因小鼠成纖維細胞株L929-B7-2、Daudi以及小鼠脾臟細胞的陽性結合率分別為99.3％、96.7％及61.2％。
　　結論：B7-2單克隆抗體能夠特異性識別不同細胞膜型B7-2分子。
　　第二部分：慢性移植物抗宿主病狼瘡樣腎炎小鼠模型的建立及病理性鑒定。
　　目的：對慢性移植物抗宿主病狼瘡樣腎炎小鼠模型進行免疫學、血清學及腎臟病理損傷鑒定。以考察該模型作為SLE疾病模型的可靠性。
　　方法：將

6、親代雌性BALB/c小鼠脾臟細胞懸液經(jīng)尾靜脈注射(C57BL/J6×BALB/c) F1代小鼠,每隔3天注射1次,共4次。建模后1周,采用免疫熒光及流式細胞儀分析小鼠脾臟中抗原提呈細胞(APC)及抗體形成細胞的百分率。每隔2周檢測血清中anti-dsDNA抗體及ANA;每隔4周檢測尿蛋白量的動態(tài)變化;建模12周終止實驗,取腎臟組織作HE染色觀察病理改變,直接免疫熒光法檢測免疫復合物(IC)沉積以及透射電鏡觀察腎小球超微結構變化。

7、　　結果：流式細胞術的分析結果顯示,造模后1周脾臟中膜型CD11b+、CD11c+及GR1+細胞的百分率較對照組明顯升高(P<0.05),同時抗體形成細胞 B220+表面 CD21、CD23、 CD80及 CD86分子的表達均上調(P<0.05);建模2周時,血清anti-dsDNA抗體出現(xiàn)陽性,4周時ANA出現(xiàn)陽性;12周時80％的小鼠存在蛋白尿,蛋白含量++~++++;腎小球體積增大并有大量炎性細胞浸潤;腎臟IC沉積;透射電鏡下可見

8、腎基底膜節(jié)段性增厚,臟層上皮細胞和基底膜之間存在大量的電子致密物。
　　結論：慢性移植物抗宿主病狼瘡樣腎炎小鼠模型具有人類SLE相似的免疫細胞異常活化及腎臟病理損傷的特征性表現(xiàn),用于相關研究具有可靠性。
　　第三部分：B7-2單克隆抗體對狼瘡樣腎炎小鼠模型的免疫干預效應及分子機制的研究。
　　目的：探討B(tài)7-2單克隆抗體通過阻斷或削弱B7/CD28信號通路對狼瘡樣腎炎小鼠模型的免疫干預效應及可能的分子機制。
　　

9、方法：按第二部分的建模方法,取雌性BCF1代小鼠隨機分為3組,模型組、抗體干預組及對照組,每組15只。干預組在末次注射淋巴細胞后的第1、3、5、8及15d分別尾靜脈注射B7-2單抗(克隆1D1)8mg/kg,然后每月再注射1次,連續(xù)注射2次。模型組同一時間給予等劑量的小鼠Ig同型對照。分析脾臟中巨噬細胞(CD11b+)、樹突狀細胞(CD11c+)、中性粒細胞(Gr1+)的百分率及抗體形成細胞B220+細胞表面CD21、CD23、CD80

10、及CD86分子的表達量,anti-dsDNA抗體、ANA含量,尿蛋白含量,免疫復合物,腎小球形態(tài)結構和超微結構改變等指標。
　　結果：免疫熒光分析干預組小鼠CD11b+、CD11c+及GR1+細胞的百分率上調程度均低于模型組(p<0.05);同時干預組B220+細胞表面CD21、CD23、CD80及CD86分子表達上調程度均低于模型組(p<0.05),提示B7-2單抗可以阻斷或削弱B7/CD28信號通路,從而抑制機體的免疫應答;模

11、型組90％的小鼠血清能檢測到anti-dsDNA抗體和ANA的表達,干預組僅有40％,且干預組的血清抗體滴度明顯低于模型組;12周時80％的模型組小鼠存在蛋白尿,蛋白含量++~++++,20％的干預組小鼠存在蛋白尿,蛋白含量為+~++;模型組腎臟組織切片HE染色顯示腎臟出現(xiàn)腎小球腫脹,淋巴細胞浸潤等典型的炎性改變,干預組腎小球體積輕度增大,少許淋巴細胞浸潤,毛細血管腔及球囊腔體積基本正常,兩組相比較,干預組腎臟病理學改變輕于模型組;熒光

12、顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)模型組腎小球 IC沉積,與模型組相比,干預組沉積在腎小球上的IC少于模型組;透射電鏡超微結構檢查發(fā)現(xiàn)模型組基底膜節(jié)段性增厚,內皮下大量電子致密物沉積等病理改變,與模型組相比,干預組基底膜厚度均勻,病理改變較輕。
　　結論：B7-2單克隆抗體通過阻斷或削弱B7/CD28信號可降低免疫細胞的異?；罨?減少自身抗體的產(chǎn)生從而減輕免疫復合物對腎功能的損傷。因此B7-2單克隆抗體的免疫干預可逆轉狼瘡樣腎炎小鼠的病理損傷,提示其