強制泛素化HBcAg重組慢病毒誘導特異性免疫反應抑制HBV復制的實驗研究.pdf

1、目的：采用四質粒包裝系統(tǒng)獲得高滴度的攜帶強制泛素化HBcAg（Ub-HBcAg）融合基因的重組慢病毒顆粒，探討重組慢病毒LV-Ub-HBcAg在BALB/c小鼠體內(nèi)誘導HBV特異性體液及細胞免疫反應的效果，比較LV-Ub-HBcAg體外修飾的DC免疫和直接免疫兩種免疫方式的效果，并進一步探討LV-Ub-HBcAg誘導特異性體液及細胞免疫反應對HBV轉基因小鼠體內(nèi)病毒復制的抑制作用。
　　方法：1.應用PCR從質粒pcDNA3.1(

2、-)-Ub-HBcAg中擴增Ub-HBcAg融合基因，插入至慢病毒表達載體質粒pLOV.UBC.EGFP.3FLAG中，構建重組表達載體質粒pLOV.UBC.Ub-HBcAg.EGFP.3FLAG。使用脂質體將構建完成的重組表達載體質粒與包裝質粒pLP1、pLP2以及包膜質粒pLP/VSVG共轉染人胚腎293T細胞進行包裝，得到攜帶Ub-HBcAg融合基因的重組慢病毒顆粒LV-Ub-HBcAg，純化及Western blot鑒定。2.將

3、BALB/c小鼠隨機分為LV-Ub-HBcAg/DC、LV-HBcAg/DC、LV/DC、LV-Ub-HBcAg、LV-HBcAg、LV、DC及PBS組，經(jīng)小鼠后足墊皮下免疫小鼠，每2周一次，共2次。酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）檢測血清HBcAb滴度水平及T淋巴細胞分泌細胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4及IL-10的水平；CCK-8法檢測T淋巴細胞增殖活性；流式細胞儀檢測T淋巴細胞內(nèi)的細胞因子；酶聯(lián)免疫斑點（ELISPOT）法檢

4、測分泌IFN-γ的特異性T淋巴細胞；LDH釋放試驗檢測特異性CTL殺傷活性。3.將HBV轉基因小鼠隨機分為實驗組LV-Ub-HBcAg，對照組LV-HBcAg、HBcAg、IFN-α、LV及PBS組，經(jīng)小鼠后足墊皮下免疫小鼠，每2周一次，共2次。ELISA法檢測血清HBcAb滴度；微粒子酶免疫分析法（MEIA）檢測血清HBsAg水平；熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）法檢測HBV DNA水平；免疫生化檢測血清AST、ALT水平；ELISA法

5、檢測T淋巴細胞分泌的細胞因子IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-4及IL-10水平；流式細胞儀檢測T淋巴細胞內(nèi)的細胞因子；酶聯(lián)免疫斑點（ELISPOT）法檢測分泌IFN-γ的特異性T淋巴細胞；LDH釋放試驗檢測特異性CTL活性；HE染色檢測肝臟組織學及免疫組織化學檢測HBsAg、HBcAg的表達；實時熒光定量PCR及Western blot檢測T淋巴細胞內(nèi)T-bet及GATA-3水平。
　　結果：1.強制泛素化HBcAg融合基

6、因的重組慢病毒表達載體經(jīng)基因測序證實了所攜帶目的基因的序列及插入方向正確，重組慢病毒LV-Ub-HBcAg轉染293T細胞后通過Western blot檢測到目的基因的蛋白表達。2. LV-Ub-HBcAg、LV-Ub-HBcAg/DC均可誘導BALB/c小鼠體內(nèi)特異性體液及細胞免疫反應，兩組均能有效升高小鼠血清中HBcAb的IgG水平，其中以IgG2α亞型水平增高為主，IgG1亞型無明顯增高；兩組均可刺激小鼠T淋巴細胞增殖和特異性CT

7、L殺傷活性，分泌Th1型細胞因子IFN-γ、IL-2；流式細胞儀及ELISPOT法檢測兩組誘導的CTL水平明顯高于其他組；兩組之間免疫效果比較的差異無統(tǒng)計學意義。3. LV-Ub-HBcAg能有效升高HBV轉基因小鼠血清中IgG2α為主的HBcAb水平，促進分泌Th1型細胞因子IFN-γ、IL-2及TNF-α；LV-Ub-HBcAg誘導的特異性CTL水平明顯高于其他組；肝組織HE染色顯示LV-Ub-HBcAg組炎性細胞的數(shù)量明顯增多，免

8、疫組化顯示HBsAg、HBcAg表達明顯減少，降低小鼠血清中HBsAg及HBV DNA水平，升高血清中AST、ALT水平，LV-Ub-HBcAg可上調T-bet的表達并且下調GATA-3的表達。
　　結論：構建、包裝及純化了攜帶強制泛素化HBcAg融合基因的重組慢病毒LV-Ub-HBcAg，轉染293T細胞后可檢測到目的基因的穩(wěn)定表達。重組慢病毒LV-Ub-HBcAg體外修飾的DC免疫和直接免疫兩種免疫方式免疫BALB/c小鼠后，