基于iTRAQ技術(shù)的羅伯茨綠僵菌分生孢子和菌絲比較蛋白質(zhì)組研究.pdf

1、作為一種絲狀真菌，綠僵菌主要包括有典型的兩種不同生活史時期——分生孢子和菌絲體。分生孢子作為綠僵菌的無性繁殖單位，在其繁殖和侵染蟲體的過程中都發(fā)揮重要的角色；菌絲是綠僵菌營養(yǎng)生長階段的營養(yǎng)攝取單位。
　　目前，針對綠僵菌的高通量定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究未見報道。因此，為了進一步提高綠僵菌生物防治的應(yīng)用效果，探索綠僵菌分生孢子中重要且關(guān)鍵的代謝及調(diào)控通路，本研究采用iTRAQ技術(shù)對羅伯茨綠僵菌的分生孢子（10d）和菌絲（1d，作為對照）進

2、行了高通量定量比較蛋白質(zhì)組研究。
　　主要研究結(jié)果如下：
　　1.蛋白質(zhì)鑒定和定量分析結(jié)果顯示：共計檢測鑒定到2129種蛋白質(zhì)，約占綠僵菌總蛋白數(shù)的20％左右（2129/10581）。在相對定量時，以菌絲蛋白樣本為對照，分析了分生孢子內(nèi)的差異表達蛋白質(zhì)（當(dāng)?shù)鞍椎呢S度比即差異倍數(shù)達到1.5倍以上，且經(jīng)統(tǒng)計檢驗其p-value值小于0.05時，視該蛋白為不同樣品間的差異表達蛋白），得到239種差異表達蛋白，其中184種蛋白在孢子

3、內(nèi)表達上調(diào)，55種蛋白表達下調(diào)（均是與菌絲相比較）。這些差異表達的蛋白質(zhì)種類主要包括關(guān)鍵代謝途徑中的酶類和一般（氧化）應(yīng)激反應(yīng)蛋白質(zhì)，例如過敏原 Alt a7蛋白（minor allergen Alt a7, EFZ03492）、熱激蛋白70（heat shock protein70-like protein, EFZ01368）和類枯草桿菌蛋白酶PR1H（subtilisin-like protease PR1H,EFY94277），

4、以及參與生物合成和能量代謝的主要蛋白質(zhì)。
　　2.針對本研究鑒定到的所有蛋白質(zhì)進行COG（cluster of orthologous group）注釋分類分析，結(jié)果顯示：所有鑒定到的蛋白質(zhì)主要集中于7個功能類別，涉及能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換（energy production and conversion），氨基酸運輸和代謝（amino acid transport and metabolism），碳水化合物的運輸和代謝（carbohyd

5、rate transport and metabolism）等；這些結(jié)果表明分生孢子和菌絲內(nèi)的蛋白質(zhì)主要參與快速生長和基礎(chǔ)生物合成代謝這兩種生物學(xué)過程。
　　3.針對顯著差異表達的239種蛋白，進行了GO（Gene Ontology）富集分析，結(jié)果顯示，這些蛋白所涉及的主要生物學(xué)功能（molecular functional）表現(xiàn)為催化活性、結(jié)合活性、電子載體活性、結(jié)構(gòu)分子活性和酶活性調(diào)節(jié)。根據(jù)生物學(xué)過程（biological p

6、rocess）分類，差異蛋白的種類主要分布于代謝過程、細胞過程、單生物過程、生物調(diào)節(jié)和應(yīng)激反應(yīng)中。此外，根據(jù)細胞成分（cellular components）分類，239種蛋白質(zhì)存在于如細胞、細胞器、大分子復(fù)合物和細胞膜等各種細胞成分中?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明了基因表達的調(diào)控和代謝通路在分生孢子和菌絲之間呈現(xiàn)顯著的動態(tài)變化，顯示了綠僵菌分生孢子和菌絲體之間多個生物過程的生理、生化和形態(tài)差異。
　　4.針對顯著差異表達的239種蛋白

7、，進一步進行了KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析，結(jié)果顯示約60%（4/7）顯著富集的通路參與相關(guān)的降解過程，包括苯乙烯降解（ko00643），苯乙烷降解（ko00642），香葉醇降解（ko00281），纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解（ko00280）。另外三個顯著富集通路是不同環(huán)境中微生物的新陳代謝通路（ko01120）、氰基氨基酸代謝（ko00460）和泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水

8、解（ko04120）。特別值得注意的，苯乙烯降解、苯乙烷降解、香葉醇降解三種代謝通路主要涉及次生代謝，而這些次生代謝產(chǎn)物參與抑制分生孢子萌發(fā)，即分生孢子中富含一些蛋白能夠消除分生孢子萌發(fā)的抑制現(xiàn)象；與此同時，由以上四種降解代謝途徑結(jié)合氰基氨基酸代謝可能會提供更多的碳源和氮源，為孢子萌發(fā)提供基礎(chǔ)代謝支持。此外，與抗逆境脅迫相關(guān)的蛋白顯著富集于泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解通路，這個結(jié)果表明，在特定條件下，分生孢子主要通過清除受損蛋白來抵抗逆境壓迫，