比較蛋白質(zhì)組學(xué)解析綠針假單胞菌G5菌株GacA功能.pdf

1、GacS/GacA雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)普遍存在于革蘭氏陰性細(xì)菌中，它主要通過控制RsmB家族sRNAs的轉(zhuǎn)錄拮抗翻譯抑制蛋白R(shí)smA全局調(diào)控多種細(xì)菌生理活動(dòng)和行為，包括運(yùn)動(dòng)性與生物膜形成、胞外酶、抗生素和植物生長(zhǎng)素 IAA的產(chǎn)生等，與細(xì)菌的生防活性或致病性，以及細(xì)菌耐藥性、植物生長(zhǎng)促進(jìn)等密切相關(guān)。因此，在食品、農(nóng)業(yè)、環(huán)境、醫(yī)療和生物制藥相關(guān)細(xì)菌的研究中受到廣泛關(guān)注。GacS/GacA系統(tǒng)由感應(yīng)激酶GacS和反應(yīng)調(diào)控子GacA組成，GacA

2、在不同細(xì)菌中高度保守，但 Gac系統(tǒng)調(diào)控的功能在不同細(xì)菌屬種或菌株中，以及不同生長(zhǎng)環(huán)境中表現(xiàn)出明顯的差異。綠針假單胞菌G5是分離自香菜的內(nèi)生菌，前期研究表明G5能產(chǎn)生蛋白酶，幾丁質(zhì)酶和嗜鐵素；以及氫氰酸（HCN），吩嗪和IAA等次生代謝物質(zhì)，具有生防活性和植物生長(zhǎng)促進(jìn)作用。然而在菌株 G5中GacA的調(diào)控作用目前尚不清楚。
　　本研究以綠針假單胞菌G5為目標(biāo)菌株，利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)方法首次全局解析了穩(wěn)定生長(zhǎng)期gacA突變對(duì)全細(xì)胞蛋

3、白表達(dá)譜，以及外分泌蛋白表達(dá)譜的影響；并借助于生物信息學(xué)等方法對(duì)鑒定蛋白的功能進(jìn)行了深入分析；進(jìn)一步通過表型分析對(duì)GacA調(diào)控的關(guān)鍵差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行了驗(yàn)證。以期更好地了解gacA在菌株G5中的生物學(xué)功能。GacA作為全局性調(diào)控子，研究其分子功能不僅可以進(jìn)一步了解其復(fù)雜的級(jí)聯(lián)調(diào)控機(jī)制，也有利于從分子水平上改良G5的生防性狀。旨在為研發(fā)環(huán)境友好的多功能生物農(nóng)藥/肥料，保護(hù)生態(tài)、實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展，保障食品安全和人類健康奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如

4、下：
　　1)野生菌G5和gacA突變體G5-6培養(yǎng)24h至穩(wěn)定期后，運(yùn)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析了gacA失活對(duì)全細(xì)胞蛋白和外分泌蛋白表達(dá)豐度的影響，質(zhì)譜鑒定出244個(gè)豐度變化2倍以上的蛋白點(diǎn)，代表著210種蛋白。和野生菌G5相比，gacA突變體全細(xì)胞蛋白中有38個(gè)點(diǎn)豐度上升，89個(gè)下降；細(xì)胞外分泌蛋白中91個(gè)蛋白點(diǎn)豐度上升，26個(gè)蛋白點(diǎn)豐度下降。
　　2) GO功能分析顯示這些差異蛋白點(diǎn)參與多種生物學(xué)過程，包括氨基酸、糖類、脂

5、、脂肪、核酸及無機(jī)物質(zhì)的代謝，蛋白質(zhì)的折疊與降解，底物轉(zhuǎn)運(yùn)，分泌，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，防御反應(yīng)和氧化還原脅迫等。在鑒定的蛋白中，39個(gè)蛋白點(diǎn)與脅迫反應(yīng)相關(guān)，33個(gè)蛋白點(diǎn)與底物轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，29個(gè)蛋白點(diǎn)與氨基酸合成代謝相關(guān)，26個(gè)蛋白點(diǎn)則參與了碳水化合物的代謝與能量轉(zhuǎn)換。KEGG分析顯示多個(gè)蛋白參與了TCA循環(huán)，糖酵解，糖異生等代謝通路。主要差異蛋白點(diǎn)描述如下：
　　3) GacA正調(diào)控G5菌株生防因子的產(chǎn)生。蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明與吩嗪抗生素生物合

6、成相關(guān)的蛋白PhzB、PhzF、PhzD和PhzO在突變體中均不表達(dá)。堿性蛋白酶AprA，幾丁質(zhì)酶ChiC_1、ChiC_2以及絲氨酸蛋白酶PspA、PspB的表達(dá)水平也顯著下降。表型分析表明gacA失活致使G5失去蛋白質(zhì)水解能力。
　　4) GacA正調(diào)控T6SS分泌系統(tǒng)的表達(dá)。gacA突變顯著降低了VI型分泌系統(tǒng)中TssC2、效應(yīng)因子Hcp、Vgr家族蛋白的表達(dá)，暗示著GacA突變可能影響細(xì)菌與細(xì)菌之間，以及與植物寄主之間的相

7、互作用。
　　5) GacA與細(xì)菌生態(tài)適應(yīng)性密切相關(guān)。嚴(yán)謹(jǐn)饑餓蛋白SspA及超氧化物歧化酶SodB在突變體中的表達(dá)量均升高10倍以上。表型分析證實(shí)了GacA負(fù)調(diào)控超氧化物歧化酶SOD及過氧化氫酶活性，可能影響細(xì)菌的脅迫耐受性。
　　6)四個(gè)與鞭毛合成與裝配相關(guān)的蛋白FliC、FlgK、FlgL和FliI在gacA突變體中的表達(dá)水平均升高。鞭毛提取組合SDS-PAGE和質(zhì)譜鑒定證實(shí)了GacA負(fù)調(diào)控鞭毛蛋白的合成。突變體中鞭毛蛋

8、白豐度增加，而細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性下降表明細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性受多種因素影響，并非完全依賴于鞭毛蛋白。
　　7) GacA突變改變了細(xì)胞外膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致了細(xì)胞壁肽聚糖合成蛋白Ddl和LPS脂多糖合成相關(guān)的LxpC蛋白表達(dá)水平升高。進(jìn)一步Tricine SDS-PAGE分析證明了gacA突變體中脂多糖LPS合成增加。
　　8) gacA突變降低了植物生長(zhǎng)素IAA合成相關(guān)的鄰氨基苯甲酸合成酶TrpE蛋白的表達(dá)水平。HPLC檢測(cè)證實(shí)gacA突變后IAA