子癇前期蛻膜組織比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、子癇前期是妊娠期特有疾病，是妊娠高血壓疾病的最常見類型，起病于34孕周前的重度子癇前期稱為早發(fā)型重度子癇前期(ES-PE)，在34孕周以后發(fā)病的重度子癇前期稱為晚發(fā)型重度子癇前期(LS-PE)。目前子癇前期仍然沒有理想的標(biāo)志物，具體的發(fā)病機制仍未闡明。近年研究發(fā)現(xiàn)早發(fā)型重度子癇前期與晚發(fā)型重度子癇前期不僅是發(fā)病時間上存在差異，在發(fā)病機制、臨床靶器官損害、臨床治療及預(yù)后等方面都有明顯不同。蛋白質(zhì)組學(xué)是近年來發(fā)展的新技術(shù)，主要包含蛋白質(zhì)分離

2、、蛋白質(zhì)鑒定和生物信息學(xué)三大部分，具有高通量和高靈敏度等優(yōu)點。人體蛻膜組織是母胎界面重要組成部分，與胎兒滋養(yǎng)層直接接觸，有參與母胎免疫耐受形成及維持妊娠的功能。為探討子癇前期的發(fā)病機制和尋找該病的蛋白質(zhì)標(biāo)志物，既往國內(nèi)外學(xué)者曾運用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對子癇前期患者的外周血、腦脊液、羊水和胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞等進行了各種研究。關(guān)于子癇前期蛻膜組織的蛋白質(zhì)組學(xué)研究尚未見報道。本實驗利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，通過比較早發(fā)型重度子癇前期、晚發(fā)型重度子癇前期患者和正

3、常足月妊娠婦女蛻膜組織的蛋白表達差異，探討引起子癇前期發(fā)生的可能因素及尋找子癇前期是否存在標(biāo)志蛋白，為研究子癇前期的發(fā)病機制和診斷提供依據(jù)。 第一章子癇前期蛻膜組織差異表達蛋白的分離與鑒定 目的：探討早發(fā)型重度子癇前期、晚發(fā)型重度子癇前期和正常足月妊娠各組蛻膜組織差異蛋白表達譜的變化，篩選出早發(fā)型重度子癇前期和晚發(fā)型重度子癇前期相關(guān)蛋白。 方法：正常足月妊娠、早發(fā)型重度子癇前期和晚發(fā)型重度子癇前期各6例，剖宮產(chǎn)術(shù)

4、中取出蛻膜組織，采用一步抽提法制備各組蛻膜組織的總蛋白，應(yīng)用雙向凝膠電泳技術(shù)建立正常足月妊娠、早發(fā)型重度子癇前期和晚發(fā)型重度子癇前期蛻膜組織雙向凝膠電泳圖譜。PDQuest軟件進行圖像分析分別對各組蛻膜組織總蛋白的雙向電泳圖譜進行了分析比較，隨機選擇各組間的差異點共30個進行膠內(nèi)酶解，用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)分析獲得肽質(zhì)量指紋譜，搜尋蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫鑒定蛋白質(zhì)并進行初步功能分析。 結(jié)果：

5、 1.建立了分辨率高、重復(fù)性好的正常足月妊娠、早發(fā)型重度子癇前期和晚發(fā)型重度子癇前期蛻膜組織的2-DE圖譜，其中蛋白質(zhì)點正常足月妊娠組(425±16)個，早發(fā)型重度子癇前期組(408±10)個，晚發(fā)型重度子癇前期組(436±13)個。 2.PDQuest進行圖像分析軟件對三組2-DE圖譜進行比較分析，以比值大于2或小于2的蛋白質(zhì)斑點作為顯著差異表達的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。隨機選擇9個晚發(fā)組和正常妊娠組的差異蛋白質(zhì)點和11個早發(fā)組與晚發(fā)組中

6、差異點和15個早發(fā)組與正常妊娠組中的差異點進行質(zhì)譜鑒定分析，共鑒定出29種差異蛋白質(zhì)。 3.鑒定出29種蛋白質(zhì)按功能分為10類：①細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白質(zhì)；②信號傳導(dǎo)相關(guān)蛋白；③能量與代謝相關(guān)的酶類；④鈣結(jié)合蛋白質(zhì)；⑤其他(fibrinogen double fragment、fibrinogen beta chain precursor、proteasome endopeptidase complex[3.4.5.1]P42 cha

7、in、hemoglobin beta chain)；⑥抗氧化物酶類；⑦分子伴侶；⑧運輸?shù)鞍?；⑨防御性蛋白；⑩未知蛋白?結(jié)論： 1.成功建立正常足月妊娠、早發(fā)型重度子癇前期和晚發(fā)型重度子癇前期蛻膜組織總蛋白質(zhì)的2-DE圖譜，共鑒定了出29種差異蛋白質(zhì)。 2.多個能量代謝相關(guān)的蛋白和多個凝血功能相關(guān)的蛋白在正常妊娠組和子癇前期組之間存在表達差異推測：母胎界面缺氧應(yīng)激和血液高凝狀態(tài)可能是子癇前期發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

8、 3.首次進行了早發(fā)型子癇前期的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)了早發(fā)型子癇前期蛻膜組織與晚發(fā)型子癇前期蛻膜組織相比存在差異蛋白，提示早發(fā)型子癇前期的發(fā)病機制可能不同于晚發(fā)型子癇前期。 第二章子癇前期蛻膜組織比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究 目的：驗證蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果，對部分差異表達蛋白質(zhì)在正常足月妊娠、早發(fā)型重度子癇前期和晚發(fā)型重度子癇前期蛻膜組織中的mRNA及蛋白表達水平進行檢測，分析其臨床意義。 方法：收集正常足月妊娠、早發(fā)型

9、重度子癇前期和晚發(fā)型重度子癇前期各10例蛻膜組織，分別采用熒光實時定量PCR、Western blot和免疫組織化學(xué)技術(shù)分別對正常足月妊娠婦女、早發(fā)型重度子癇前期及晚發(fā)型重度子癇前期蛻膜組織中的AnnexinⅤ和Rho-GDI的mRNA及蛋白進行檢測。 結(jié)果 1.熒光實時定量PCR,Western blot和免疫組化等結(jié)果顯示Annexin Ⅴ mRNA及蛋白在正常妊娠組蛻膜組織中表達最高，晚發(fā)型子癇前期組中次之，早發(fā)型

10、子癇前期中最低，正常妊娠組與早發(fā)組和晚發(fā)組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致。 2.熒光實時定量PCR、Western blot和免疫組化等結(jié)果顯示Rho-GDI mRNA及蛋白在正常妊娠組蛻膜組織中表達最高，早發(fā)型子癇前期組中次之，晚發(fā)型子癇前期中最低，正常妊娠組與早發(fā)組和晚發(fā)組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致。 結(jié)論： 1.蛻膜組織中Annexin Ⅴ和Rho-GDI各組間存在差異表達，差異表達水平

11、與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果基本一致。 2.AnnexinⅤ在子癇前期蛻膜組織中表達下調(diào)，AnnexinⅤ的低表達可能與子癇前期高凝狀態(tài)形成有關(guān)。 3.Rho-GDI在子癇前期蛻膜組織中表達下調(diào)，Rho-GDI可能通過血壓調(diào)節(jié)和缺氧應(yīng)激等多個環(huán)節(jié)參與了子癇前期的發(fā)生發(fā)展。 第三章α1-antitrypsin在子癇前期患者蛻膜組織中的表達和母體外周血中的濃度變化及其臨床意義 目的：對α1-antitrypsin在正常足月妊娠、

12、早發(fā)型重度子癇前期和晚發(fā)型重度子癇前期蛻膜組織中的表達水平進行檢測，驗證蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果，并研究母體外周血清α1-抗胰蛋白酶蛋白濃度變化和探討其臨床意義。 方法：采用熒光實時定量PCR、Western blot和免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測α1-antitrypsin在正常足月妊娠、早發(fā)型重度子癇前期和晚發(fā)型重度子癇前期各10例蛻膜組織中的表達，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測每組各20例母體外周血清α1-antitrypsin的濃度。

13、 結(jié)果： 1.熒光實時定量PCR、Western blot和免疫組化等結(jié)果顯示α1-抗胰蛋白酶mRNA及蛋白在正常妊娠組蛻膜組織中表達最高；早發(fā)型子癇前期組中次之；晚發(fā)型子癇前期中最低，差異有顯著性意義。 2.母體外周血清α1-antitrypsin的濃度在正常妊娠組表達最高(1.85±0.15g/L)；早發(fā)型子癇前期組中次之(0.77±0.14g/L)和晚發(fā)型子癇前期中最低(0.42±0.07g/L)，差異有顯