羅伯茨綠僵菌幾丁質(zhì)合成酶與致病性和抗逆的關(guān)系研究.pdf

1、幾丁質(zhì)(chitin)是真菌細(xì)胞壁的重要結(jié)構(gòu)成分，它與葡聚糖一起構(gòu)成細(xì)胞壁堅(jiān)固的骨架，對(duì)于維持細(xì)胞形態(tài)，防止外源物的入侵等起著重要的保護(hù)作用。同時(shí)，幾丁質(zhì)也是一種病原菌相關(guān)模式分子(Pathogen-Associated MolecularPattern，PAMP)，能誘導(dǎo)宿主的免疫應(yīng)答;在一些致病真菌中（如植物病原真菌—稻瘟病菌等），幾丁質(zhì)合成酶已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)與致病性相關(guān)。羅伯茨綠僵菌(M.robertsii），是重要昆蟲(chóng)病原真菌，正在被

2、開(kāi)發(fā)為真菌殺蟲(chóng)劑，用于防治農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，衛(wèi)生害蟲(chóng)和它們所傳播的疾病，但其存在著殺蟲(chóng)速度慢和防效不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，研究羅伯茨綠僵菌的致病機(jī)理可為創(chuàng)建高效安全的真菌殺蟲(chóng)劑提供理論依據(jù)。目前，幾丁質(zhì)合成酶與羅伯茨綠僵菌致病性相關(guān)的研究尚未被報(bào)導(dǎo)。為此，本文從羅伯茨綠僵菌(M.robertsii)中鑒定了所有幾丁質(zhì)合成酶，并闡明了它們?cè)诎l(fā)育、致病和抗非生物逆境中的功能，主要結(jié)果分述如下:
　　利用釀酒酵母(S.cerevisiae)和稻瘟病菌（M

3、.oryzae）等的幾丁質(zhì)合成酶作為queries，我們從羅伯茨綠僵菌中鑒定到7個(gè)可能的幾丁質(zhì)合成酶，經(jīng)結(jié)構(gòu)域分析(PFAM database)發(fā)現(xiàn)，這7個(gè)蛋白均含有典型的幾丁質(zhì)合成酶結(jié)構(gòu)域(domain structure);并且都有保守的CON1結(jié)構(gòu)域(QxxEY, EDRxL，QxRRW)。利用來(lái)自多個(gè)真菌幾丁質(zhì)合成酶的CON1序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，羅伯茨綠僵菌幾丁質(zhì)合成酶分別位于7個(gè)clades。根據(jù)結(jié)構(gòu)域分析和系統(tǒng)發(fā)育研究

4、的結(jié)果，我們把它們分別命名為ChsⅠ(Maa-02999)、ChsⅡ(Maa-02740)、ChsⅢ(Maa-03168)、ChsⅣ(Maa-00137)、ChsⅤ(Maa-01111)、ChsⅥ(Maa-01099)和ChsⅦ(Maa-01112)。
　　通過(guò)表達(dá)分析我們發(fā)現(xiàn)，除了ChsⅥ，其他幾丁質(zhì)合成酶在生長(zhǎng)發(fā)育和致病的各個(gè)階段都表達(dá);ChsⅤ和ChsⅦ有著類似的表達(dá)規(guī)律，在侵染階段（附著胞階段）和生長(zhǎng)發(fā)育階段（產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、芽

5、生孢子和萌發(fā)）都有比較強(qiáng)的表達(dá)，但附著胞階段表達(dá)量最高。為了研究幾丁質(zhì)合成酶家族的生物學(xué)功能，我們構(gòu)建以上7類幾丁質(zhì)合成酶的敲除株和回補(bǔ)株。
　　在腐生階段，△ChsⅠ、△ChsⅡ、△ChsⅤ和△ChsⅦ在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)明顯受到抑制?！鰿hsⅤ和△ChsⅦ的產(chǎn)孢量顯著比野生型菌株降低，與此相對(duì)應(yīng)，這兩個(gè)突變體的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)異常;與野生型菌株相比，突變體的分子孢子梗的數(shù)目明顯減少。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，△ChsⅤ和△ChsⅦ的細(xì)胞表面疏

6、水結(jié)構(gòu)(Rodletstructure)明顯受損。
　　與野生型菌株相比，△ChsⅤ和△ChsⅦ的侵染毒力明顯降低。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，△ChsⅤ和△ChⅦ的附著胞異常，附著胞內(nèi)部有膨大的類似液泡的結(jié)構(gòu)填充，△ChsⅤ和△ChsⅦ的附著胞膨壓與野生型菌株相比明顯降低。
　　對(duì)羅伯茨綠僵菌的7類幾丁質(zhì)合成酶敲除株在非生物逆境（高溫、高滲、氧化環(huán)境和細(xì)胞壁破損處理）條件下生長(zhǎng)速率測(cè)定發(fā)現(xiàn):在高溫條件下△ChsⅡ和△ChsⅤ是致死的，△C

7、hsⅠ和△ChsⅦ明顯受到抑制;此外對(duì)來(lái)自9個(gè)門的231個(gè)真菌的幾丁質(zhì)合成酶家族進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)來(lái)自盤菌亞門(Pezizomycotina)的95個(gè)物種含有ChsⅤ和ChsⅦ，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)它們?cè)诨蚪M上是通過(guò)基因的串聯(lián)復(fù)制(Tandem duplication)產(chǎn)生的。在這95個(gè)物種中，78個(gè)是致病真菌，其中28個(gè)可以感染哺乳動(dòng)物（耐高溫），剩余17個(gè)腐生真菌中，10個(gè)具有耐高溫特性，而其余7個(gè)真菌與哺乳動(dòng)物病原真菌和耐高溫性真菌的親緣