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文檔簡介
1、江蘇省淮安地區(qū)是我國食管癌高發(fā)地區(qū)之一,近年來的監(jiān)測資料表明該地區(qū)的食管癌發(fā)生率和死亡率未得到明顯控制,仍位于全國前列,探索靈敏度、特異度高、簡便易行的篩查方法用于食管癌高危人群的篩檢是早期發(fā)現(xiàn)和診斷食管癌的關鍵所在。差異蛋白質組學以蛋白質為研究對象,從整體水平比較不同生理或病理條件下蛋白質表達譜的差異,以尋找與疾病相關的蛋白質分子,為構建生物標志體系提供了新的契機與方向。本研究應用iTRAQ技術對江蘇省淮安食管癌高發(fā)地區(qū)食管癌患者和健
2、康對照血漿蛋白質表達譜進行分析,篩選并評價可能用于食管癌早期篩查的潛在蛋白質標志,為腫瘤早期標志物體系的構建提供依據(jù)。
方法和結果:
1.食管癌血漿蛋白質的篩選和生物信息學分析
1.1食管癌血漿蛋白質的篩選
采用同位素相對標記與絕對定量技術(iTRAQ)與串聯(lián)質譜技術(LC-MS/MS)對江蘇省淮安地區(qū)28例新發(fā)食管癌患者血漿及28例健康對照血漿進行分析,篩選食管癌血漿蛋白質。結果顯示,得到食管癌
3、患者血漿與健康對照血漿中蛋白質共237個,其中差異表達蛋白為19個;與健康對照相比,食管癌患者血漿中表達上調超過1.5倍的蛋白質有4個,分別為ECM-1、SERPINC1、COMP、ALB;下調的蛋白質有15個,分別為CFHR1、ITIH4、C4BPA、CLU、LUM、APOA2、ALDOB、IGHA2、IGLC2、IGHA1、IGKC、Ig heavy chainⅤ-Ⅲ region BRO、Ig kappa chainⅤ-Ⅱ reg
4、ion TEW、Ig kappa chainⅤ-Ⅰ region Walker、Ig heavy chainⅤ-Ⅰ region V35。
1.2食管癌血漿蛋白質的生物信息學分析
運用生物信息學軟件對19個差異表達蛋白進行GO注釋和Pathway分析,GO分析結果顯示在生物學過程中,涉及的有免疫功能(占58%)、代謝過程(占11%)、細胞粘附(占11%)、細胞凋亡、視知覺相關、轉運過程、應激反應等;在細胞組分方面,非
5、結構性細胞基質成分所占比例較大(占54%),其次為細胞外基質(占15%)、其他細胞組分(占15%)。Pathway分析結果顯示這些差異蛋白參與的通路涉及到補體級聯(lián)信號通路,PPAR信號通路,粘著斑信號通路,果糖、甘露糖代謝通路,磷酸戊糖代謝通路,TGF-β信號通路,ECM受體通路,糖解與糖代謝信號通路。應用STRING網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫對差異表達蛋白進行相互作用分析,結果顯示19種差異表達蛋白中的ECM-1、LUM、COMP可能存在相互作用,提
6、示在食管癌的發(fā)生發(fā)展中細胞外基質蛋白可能發(fā)揮一定的作用。
2.ECM-1、LUM在食管癌細胞系及血漿中的表達
在上述19個差異蛋白中我們選取了與腫瘤發(fā)生發(fā)展關系較為密切的ECM-1、LUM,用Western-blot技術對其在食管癌細胞系EC9706、EC109及人正常食管上皮細胞Het-1A和63例原發(fā)性食管癌患者及與之匹配的63例健康對照血漿中的表達進行分析。結果表明,ECM-1在食管癌細胞系EC9706、EC1
7、09、正常食管上皮細胞Het-1A的細胞總蛋白及培養(yǎng)上清中均不表達,但在混合血漿樣品中有ECM-1的表達。食管癌患者血漿中ECM-1的表達高于其在健康對照中的表達,與質譜結果一致,且血漿樣品中表達的ECM-1蛋白為68KD的ECM-1a蛋白。
LUM在食管癌細胞系EC9706(高分化食管癌細胞株)細胞中的表達低于其在EC109(低分化食管癌細胞株)細胞中的表達,均高于其在人正常食管上皮細胞系Het-1A細胞中的表達,提示細胞中
8、LUM的表達可能與腫瘤的惡性程度有一定的關系;在EC9706、EC109及Het-1A培養(yǎng)上清中均未檢測到LUM的表達;食管癌患者血漿中LUM的表達低于其在健康對照血漿中的表達,與質譜結果一致。
3.ECM-1對EC9706和HUVEC生物學功能影響的研究
本研究構建了pEGFP-N1-ECM-1真核表達載體,并在Lipo2000TM介導下轉染食管癌細胞株EC9706,發(fā)現(xiàn)轉染48h的EC9706細胞中ECM-1的表
9、達水平最高。基于此本研究選取ECM-1轉染48h后的EC9706細胞做后續(xù)實驗,利用Matrigel基質膠粘附實驗檢測ECM-1對EC9706細胞粘附能力的影響;Transwell體外侵襲和遷移實驗觀察轉染后細胞侵襲能力和遷移能力的變化;MTT法檢測ECM-1表達對EC9706和臍靜脈內皮細胞(HUVEC)增殖能力的影響。結果表明,ECM-1的高表達與EC9706細胞增殖、粘附、侵襲功能無關,與EC9706細胞遷移功能有關;且能促進HU
10、VEC細胞體外增殖。
初步結論:
1.iTRAQ定量標記技術是篩選腫瘤蛋白標志物的重要技術之一,本研究共篩選出19個食管癌血漿蛋白質,經GO分析和Pathway分析表明這些差異蛋白質多為細胞外基質中的分泌蛋白。
2.LUM在食管癌進程中可能發(fā)揮相當于抑癌基因的作用,還有待進一步驗證;ECM-1在食管癌血漿中高表達,可能與食管癌的發(fā)生發(fā)展有關。
3.體外研究結果表明,ECM-1對食管癌細胞的形態(tài)、增
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