基于iTRAQ技術的食管癌血漿蛋白質研究.pdf

1、江蘇省淮安地區(qū)是我國食管癌高發(fā)地區(qū)之一，近年來的監(jiān)測資料表明該地區(qū)的食管癌發(fā)生率和死亡率未得到明顯控制，仍位于全國前列，探索靈敏度、特異度高、簡便易行的篩查方法用于食管癌高危人群的篩檢是早期發(fā)現(xiàn)和診斷食管癌的關鍵所在。差異蛋白質組學以蛋白質為研究對象，從整體水平比較不同生理或病理條件下蛋白質表達譜的差異，以尋找與疾病相關的蛋白質分子，為構建生物標志體系提供了新的契機與方向。本研究應用iTRAQ技術對江蘇省淮安食管癌高發(fā)地區(qū)食管癌患者和健

2、康對照血漿蛋白質表達譜進行分析，篩選并評價可能用于食管癌早期篩查的潛在蛋白質標志，為腫瘤早期標志物體系的構建提供依據(jù)。
　　方法和結果:
　　1.食管癌血漿蛋白質的篩選和生物信息學分析
　　1.1食管癌血漿蛋白質的篩選
　　采用同位素相對標記與絕對定量技術（iTRAQ）與串聯(lián)質譜技術(LC-MS/MS)對江蘇省淮安地區(qū)28例新發(fā)食管癌患者血漿及28例健康對照血漿進行分析，篩選食管癌血漿蛋白質。結果顯示，得到食管癌

3、患者血漿與健康對照血漿中蛋白質共237個，其中差異表達蛋白為19個;與健康對照相比，食管癌患者血漿中表達上調超過1.5倍的蛋白質有4個，分別為ECM-1、SERPINC1、COMP、ALB;下調的蛋白質有15個，分別為CFHR1、ITIH4、C4BPA、CLU、LUM、APOA2、ALDOB、IGHA2、IGLC2、IGHA1、IGKC、Ig heavy chainⅤ-Ⅲ region BRO、Ig kappa chainⅤ-Ⅱ reg

4、ion TEW、Ig kappa chainⅤ-Ⅰ region Walker、Ig heavy chainⅤ-Ⅰ region V35。
　　1.2食管癌血漿蛋白質的生物信息學分析
　　運用生物信息學軟件對19個差異表達蛋白進行GO注釋和Pathway分析，GO分析結果顯示在生物學過程中，涉及的有免疫功能（占58％）、代謝過程（占11％）、細胞粘附（占11％）、細胞凋亡、視知覺相關、轉運過程、應激反應等;在細胞組分方面，非

5、結構性細胞基質成分所占比例較大（占54％），其次為細胞外基質（占15％）、其他細胞組分（占15％）。Pathway分析結果顯示這些差異蛋白參與的通路涉及到補體級聯(lián)信號通路，PPAR信號通路，粘著斑信號通路，果糖、甘露糖代謝通路，磷酸戊糖代謝通路，TGF-β信號通路，ECM受體通路，糖解與糖代謝信號通路。應用STRING網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫對差異表達蛋白進行相互作用分析，結果顯示19種差異表達蛋白中的ECM-1、LUM、COMP可能存在相互作用，提

6、示在食管癌的發(fā)生發(fā)展中細胞外基質蛋白可能發(fā)揮一定的作用。
　　2.ECM-1、LUM在食管癌細胞系及血漿中的表達
　　在上述19個差異蛋白中我們選取了與腫瘤發(fā)生發(fā)展關系較為密切的ECM-1、LUM，用Western-blot技術對其在食管癌細胞系EC9706、EC109及人正常食管上皮細胞Het-1A和63例原發(fā)性食管癌患者及與之匹配的63例健康對照血漿中的表達進行分析。結果表明，ECM-1在食管癌細胞系EC9706、EC1

7、09、正常食管上皮細胞Het-1A的細胞總蛋白及培養(yǎng)上清中均不表達，但在混合血漿樣品中有ECM-1的表達。食管癌患者血漿中ECM-1的表達高于其在健康對照中的表達，與質譜結果一致，且血漿樣品中表達的ECM-1蛋白為68KD的ECM-1a蛋白。
　　LUM在食管癌細胞系EC9706（高分化食管癌細胞株）細胞中的表達低于其在EC109（低分化食管癌細胞株）細胞中的表達，均高于其在人正常食管上皮細胞系Het-1A細胞中的表達，提示細胞中

8、LUM的表達可能與腫瘤的惡性程度有一定的關系;在EC9706、EC109及Het-1A培養(yǎng)上清中均未檢測到LUM的表達;食管癌患者血漿中LUM的表達低于其在健康對照血漿中的表達，與質譜結果一致。
　　3.ECM-1對EC9706和HUVEC生物學功能影響的研究
　　本研究構建了pEGFP-N1-ECM-1真核表達載體，并在Lipo2000TM介導下轉染食管癌細胞株EC9706，發(fā)現(xiàn)轉染48h的EC9706細胞中ECM-1的表

9、達水平最高。基于此本研究選取ECM-1轉染48h后的EC9706細胞做后續(xù)實驗，利用Matrigel基質膠粘附實驗檢測ECM-1對EC9706細胞粘附能力的影響;Transwell體外侵襲和遷移實驗觀察轉染后細胞侵襲能力和遷移能力的變化;MTT法檢測ECM-1表達對EC9706和臍靜脈內皮細胞（HUVEC）增殖能力的影響。結果表明，ECM-1的高表達與EC9706細胞增殖、粘附、侵襲功能無關，與EC9706細胞遷移功能有關;且能促進HU

10、VEC細胞體外增殖。
　　初步結論:
　　1.iTRAQ定量標記技術是篩選腫瘤蛋白標志物的重要技術之一，本研究共篩選出19個食管癌血漿蛋白質，經GO分析和Pathway分析表明這些差異蛋白質多為細胞外基質中的分泌蛋白。
　　2.LUM在食管癌進程中可能發(fā)揮相當于抑癌基因的作用，還有待進一步驗證;ECM-1在食管癌血漿中高表達，可能與食管癌的發(fā)生發(fā)展有關。
　　3.體外研究結果表明，ECM-1對食管癌細胞的形態(tài)、增