基于iTRAQ技術(shù)的食管癌血漿蛋白質(zhì)研究.pdf

1、江蘇省淮安地區(qū)是我國食管癌高發(fā)地區(qū)之一，近年來的監(jiān)測資料表明該地區(qū)的食管癌發(fā)生率和死亡率未得到明顯控制，仍位于全國前列，探索靈敏度、特異度高、簡便易行的篩查方法用于食管癌高危人群的篩檢是早期發(fā)現(xiàn)和診斷食管癌的關(guān)鍵所在。差異蛋白質(zhì)組學(xué)以蛋白質(zhì)為研究對象，從整體水平比較不同生理或病理條件下蛋白質(zhì)表達(dá)譜的差異，以尋找與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)分子，為構(gòu)建生物標(biāo)志體系提供了新的契機(jī)與方向。本研究應(yīng)用iTRAQ技術(shù)對江蘇省淮安食管癌高發(fā)地區(qū)食管癌患者和健

2、康對照血漿蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行分析，篩選并評價可能用于食管癌早期篩查的潛在蛋白質(zhì)標(biāo)志，為腫瘤早期標(biāo)志物體系的構(gòu)建提供依據(jù)。
　　方法和結(jié)果:
　　1.食管癌血漿蛋白質(zhì)的篩選和生物信息學(xué)分析
　　1.1食管癌血漿蛋白質(zhì)的篩選
　　采用同位素相對標(biāo)記與絕對定量技術(shù)（iTRAQ）與串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS/MS)對江蘇省淮安地區(qū)28例新發(fā)食管癌患者血漿及28例健康對照血漿進(jìn)行分析，篩選食管癌血漿蛋白質(zhì)。結(jié)果顯示，得到食管癌

3、患者血漿與健康對照血漿中蛋白質(zhì)共237個，其中差異表達(dá)蛋白為19個;與健康對照相比，食管癌患者血漿中表達(dá)上調(diào)超過1.5倍的蛋白質(zhì)有4個，分別為ECM-1、SERPINC1、COMP、ALB;下調(diào)的蛋白質(zhì)有15個，分別為CFHR1、ITIH4、C4BPA、CLU、LUM、APOA2、ALDOB、IGHA2、IGLC2、IGHA1、IGKC、Ig heavy chainⅤ-Ⅲ region BRO、Ig kappa chainⅤ-Ⅱ reg

4、ion TEW、Ig kappa chainⅤ-Ⅰ region Walker、Ig heavy chainⅤ-Ⅰ region V35。
　　1.2食管癌血漿蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析
　　運(yùn)用生物信息學(xué)軟件對19個差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO注釋和Pathway分析，GO分析結(jié)果顯示在生物學(xué)過程中，涉及的有免疫功能（占58％）、代謝過程（占11％）、細(xì)胞粘附（占11％）、細(xì)胞凋亡、視知覺相關(guān)、轉(zhuǎn)運(yùn)過程、應(yīng)激反應(yīng)等;在細(xì)胞組分方面，非

5、結(jié)構(gòu)性細(xì)胞基質(zhì)成分所占比例較大（占54％），其次為細(xì)胞外基質(zhì)（占15％）、其他細(xì)胞組分（占15％）。Pathway分析結(jié)果顯示這些差異蛋白參與的通路涉及到補(bǔ)體級聯(lián)信號通路，PPAR信號通路，粘著斑信號通路，果糖、甘露糖代謝通路，磷酸戊糖代謝通路，TGF-β信號通路，ECM受體通路，糖解與糖代謝信號通路。應(yīng)用STRING網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)蛋白進(jìn)行相互作用分析，結(jié)果顯示19種差異表達(dá)蛋白中的ECM-1、LUM、COMP可能存在相互作用，提

6、示在食管癌的發(fā)生發(fā)展中細(xì)胞外基質(zhì)蛋白可能發(fā)揮一定的作用。
　　2.ECM-1、LUM在食管癌細(xì)胞系及血漿中的表達(dá)
　　在上述19個差異蛋白中我們選取了與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系較為密切的ECM-1、LUM，用Western-blot技術(shù)對其在食管癌細(xì)胞系EC9706、EC109及人正常食管上皮細(xì)胞Het-1A和63例原發(fā)性食管癌患者及與之匹配的63例健康對照血漿中的表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，ECM-1在食管癌細(xì)胞系EC9706、EC1

7、09、正常食管上皮細(xì)胞Het-1A的細(xì)胞總蛋白及培養(yǎng)上清中均不表達(dá)，但在混合血漿樣品中有ECM-1的表達(dá)。食管癌患者血漿中ECM-1的表達(dá)高于其在健康對照中的表達(dá)，與質(zhì)譜結(jié)果一致，且血漿樣品中表達(dá)的ECM-1蛋白為68KD的ECM-1a蛋白。
　　LUM在食管癌細(xì)胞系EC9706（高分化食管癌細(xì)胞株）細(xì)胞中的表達(dá)低于其在EC109（低分化食管癌細(xì)胞株）細(xì)胞中的表達(dá)，均高于其在人正常食管上皮細(xì)胞系Het-1A細(xì)胞中的表達(dá)，提示細(xì)胞中

8、LUM的表達(dá)可能與腫瘤的惡性程度有一定的關(guān)系;在EC9706、EC109及Het-1A培養(yǎng)上清中均未檢測到LUM的表達(dá);食管癌患者血漿中LUM的表達(dá)低于其在健康對照血漿中的表達(dá)，與質(zhì)譜結(jié)果一致。
　　3.ECM-1對EC9706和HUVEC生物學(xué)功能影響的研究
　　本研究構(gòu)建了pEGFP-N1-ECM-1真核表達(dá)載體，并在Lipo2000TM介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染食管癌細(xì)胞株EC9706，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染48h的EC9706細(xì)胞中ECM-1的表

9、達(dá)水平最高。基于此本研究選取ECM-1轉(zhuǎn)染48h后的EC9706細(xì)胞做后續(xù)實驗，利用Matrigel基質(zhì)膠粘附實驗檢測ECM-1對EC9706細(xì)胞粘附能力的影響;Transwell體外侵襲和遷移實驗觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞侵襲能力和遷移能力的變化;MTT法檢測ECM-1表達(dá)對EC9706和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）增殖能力的影響。結(jié)果表明，ECM-1的高表達(dá)與EC9706細(xì)胞增殖、粘附、侵襲功能無關(guān)，與EC9706細(xì)胞遷移功能有關(guān);且能促進(jìn)HU

10、VEC細(xì)胞體外增殖。
　　初步結(jié)論:
　　1.iTRAQ定量標(biāo)記技術(shù)是篩選腫瘤蛋白標(biāo)志物的重要技術(shù)之一，本研究共篩選出19個食管癌血漿蛋白質(zhì)，經(jīng)GO分析和Pathway分析表明這些差異蛋白質(zhì)多為細(xì)胞外基質(zhì)中的分泌蛋白。
　　2.LUM在食管癌進(jìn)程中可能發(fā)揮相當(dāng)于抑癌基因的作用，還有待進(jìn)一步驗證;ECM-1在食管癌血漿中高表達(dá)，可能與食管癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。
　　3.體外研究結(jié)果表明，ECM-1對食管癌細(xì)胞的形態(tài)、增