雷公藤甲素醇質(zhì)體活性的研究.pdf

1、雷公藤甲素是各種雷公藤制劑的主要活性成分之一，其相關(guān)效價(jià)比雷公藤總苷高100～200倍。在發(fā)揮強(qiáng)大免疫抑制作用的同時(shí)，雷公藤甲素也是雷公藤起毒性作用的主要組成成分，從而在一定程度上限制了它的臨床應(yīng)用，尤其是系統(tǒng)給藥途徑。因此，雷公藤甲素外用給藥成為擴(kuò)大在皮膚科臨床應(yīng)用的理想選擇。醇質(zhì)體是近年來(lái)藥物傳遞系統(tǒng)中一種新的脂質(zhì)體載體，它的物理化學(xué)特性使它能更有效地運(yùn)送藥物通過(guò)角質(zhì)層到達(dá)皮膚更深層。研究雷公藤甲素醇質(zhì)體的體外透皮效果及在體抗炎療效

2、，為本課題研究目的之一。同時(shí)將不同濃度的雷公藤甲素作用于體外培養(yǎng)的ECV304細(xì)胞株，觀測(cè)雷公藤甲素對(duì)ECV304細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)及其對(duì)細(xì)胞株端粒酶活性的影響，探討雷公藤甲素對(duì)血管生成的抑制作用，為本課題研究目的之二。
　　課題目的：
　　1、本研究以制備雷公藤甲素醇質(zhì)體為研究切入點(diǎn)，以期充分發(fā)揮雷公藤甲素的生物活性，而降低藥物毒副作用，擴(kuò)大其在皮膚科的應(yīng)用，同時(shí)為臨床上皮膚科外用制劑研發(fā)提供新思路。
　　2、為了科學(xué)

3、的評(píng)價(jià)雷公藤甲素醇質(zhì)體藥效可能的機(jī)制。本研究采用Franz擴(kuò)散池檢測(cè)體外透皮效果，采用反射分光光度儀檢測(cè)雷公藤甲素醇質(zhì)體在體抗炎作用，為該藥的外用制劑臨床研究提供科學(xué)的數(shù)據(jù)。
　　3、為評(píng)價(jià)雷公藤甲素醇質(zhì)體活性，將不同濃度的雷公藤甲素分別地作用于體外培養(yǎng)的ECV304細(xì)胞株，觀察對(duì)ECV304細(xì)胞株的抑制增殖效應(yīng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用以及其對(duì)細(xì)胞株端粒酶活性的影響。
　　試驗(yàn)方法：
　　1、醇質(zhì)體的制備：醇質(zhì)體制備采用薄膜

4、水化法與超聲法結(jié)合成改良的新方法。
　　2、醇質(zhì)體粒徑分析：采用激光動(dòng)態(tài)散射儀檢測(cè)醇質(zhì)體粒徑進(jìn)行分析，測(cè)定五個(gè)不同批次的醇質(zhì)體，計(jì)算平均粒徑。
　　3、醇質(zhì)體的包封率(EE％)：雷公藤甲素醇質(zhì)體采用超速離心法分離未包封的部分，藥物含量采用HPLC檢測(cè)。
　　4、體外大鼠皮膚透皮實(shí)驗(yàn)：大鼠脫毛后獲得皮膚標(biāo)本，分離角質(zhì)層和有活力的表皮（SCE）用于透皮實(shí)驗(yàn)，透皮研究使用Franz擴(kuò)散池。
　　5、藥物的HPLC檢測(cè)：

5、HPLC分析均在室溫下進(jìn)行，煙酸甲酯檢測(cè)波長(zhǎng)為218nm，雷公藤甲素的檢測(cè)波長(zhǎng)為219nm。
　　6、醇質(zhì)體制劑的大鼠在體抗炎活性：采用反射分光光度儀檢測(cè)在體抗炎作用。
　　7、ECV304細(xì)胞株抑制率測(cè)定：采用四甲基偶氮唑鹽比色試驗(yàn)法（MTT）檢測(cè)。
　　8、凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察：采用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察。
　　9、端粒酶活性檢測(cè):TRAP-ELISA法，具體使用TeloTAGGGTelomerasePCRELI

6、SA端粒酶活性檢測(cè)試劑盒進(jìn)行端粒酶活性的檢測(cè)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1、本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)醇質(zhì)體的粒徑隨乙醇濃度增加而下降，隨磷脂濃度增加而增加。乙醇和磷脂量對(duì)載體的包封率有正影響，即乙醇和磷脂的量越高，醇質(zhì)體中包封的雷公藤甲素越多。雷公藤甲素是脂溶性藥物，通常脂溶性藥物的醇質(zhì)體包封率相對(duì)比較高。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在卵磷脂3％(v/v)、乙醇為30(v/v)配比下，制備的醇質(zhì)體制劑(179.4±28.9nm)粒徑最大，而在卵磷脂1-2

7、％(v/v)、乙醇為45(v/v)配比下，制劑粒徑最小(50nm左右)，雷公藤甲素醇質(zhì)體中藥物包封率均超過(guò)了85％。最優(yōu)化處方的選擇采用粒徑、包封率為指標(biāo)進(jìn)行衡量，發(fā)現(xiàn)醇質(zhì)體制劑在卵磷脂為2％(v/v)、乙醇為45％(v/v)處方配比下，粒徑小、粒徑分布均勻和包封率高，雷公藤甲素醇質(zhì)體中藥物包封率達(dá)到了98％。
　　2、采用各種煙酸甲酯和雷公藤甲素制劑透過(guò)大鼠皮膚SCE進(jìn)入Franz擴(kuò)散池來(lái)進(jìn)行體外透皮實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示煙酸甲酯醇質(zhì)體

8、的24小時(shí)透皮累積量(74.0％)>空白醇質(zhì)體/煙酸甲酯水醇溶液(54.2％)>水醇溶液(31.2％)>水溶液(17.4％)。透皮延遲時(shí)間顯示，煙酸甲酯醇質(zhì)體(無(wú))﹤空白醇質(zhì)體/水醇藥物溶液混合物﹤水醇溶液﹤水溶液；時(shí)間分別為0、1、2、3小時(shí)。統(tǒng)計(jì)分析表明，煙酸甲酯四種劑型24小時(shí)透皮累積量比較，F(xiàn)=717.5，P<0.01，有顯著性差異；兩兩比較，所有P值均<0.01，有顯著性差異。雷公藤甲素各種制劑的通過(guò)SCE的體外透皮結(jié)果與煙酸

9、甲酯的透皮相似。24小時(shí)透皮累積量的結(jié)果顯示，雷公藤甲素醇質(zhì)體達(dá)83.7％、空白醇質(zhì)體/雷公藤甲素水醇溶液達(dá)59.4％、而水醇溶液達(dá)36.8％。透皮延遲時(shí)間分別為水醇溶液2h、空白醇質(zhì)體/水醇藥物溶液混合物1h、雷公藤甲素醇質(zhì)體無(wú)。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，雷公藤甲素三種劑型的24小時(shí)透皮累積量比較，F(xiàn)=170.3，P<0.01，有顯著性差異；兩兩較，所有P值均<0.01，有顯著性差異。
　　3、研究采用一種反射分光光度法來(lái)評(píng)價(jià)外用空白醇質(zhì)體

10、可能引起的紅斑。結(jié)果顯示，空白醇質(zhì)體的ΔEI與生理鹽水溶液（對(duì)照）比較沒(méi)有顯著性差異，而水-乙醇混合溶液與醇質(zhì)體制劑或生理鹽水溶液相比有顯著性差異(6h，24h，48h的F值分別為1562.7、1034.3、2814.6，p值均<0.01)。煙酸甲酯醇質(zhì)體（此醇質(zhì)體是未分離游離藥物的煙酸甲酯醇質(zhì)體）與其水醇溶液或者水溶液相比，以特別的高ΔEI值為特點(diǎn)，而且早期出現(xiàn)明顯紅斑，由煙酸甲酯醇質(zhì)體引起的紅斑指數(shù)變化曲線中可見(jiàn)，在1小時(shí)處產(chǎn)生一個(gè)

11、峰，而后長(zhǎng)達(dá)10小時(shí)內(nèi)恒定。
　　4、采用不同皮膚位點(diǎn)用煙酸甲酯制劑進(jìn)行預(yù)處理誘發(fā)紅斑，然后應(yīng)用雷公藤甲素制劑，隨之出現(xiàn)紅斑消退現(xiàn)象。結(jié)果顯示，雷公藤甲素醇質(zhì)體比雷公藤甲素非醇質(zhì)體溶液能更快地使紅斑消退。煙酸甲酯制劑后，使用雷公藤甲素醇質(zhì)體制劑處理3小時(shí)后的位點(diǎn)上發(fā)現(xiàn)誘發(fā)的紅斑完全消退；水-乙醇混合溶液和雷公藤甲素的水溶液處理后的位點(diǎn)可見(jiàn)有誘發(fā)紅斑的存在。實(shí)驗(yàn)中，同時(shí)采用空白醇質(zhì)體進(jìn)行觀測(cè)醇質(zhì)體制劑中的組分可能對(duì)化學(xué)誘發(fā)性紅斑的干

12、擾作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)空白醇質(zhì)體沒(méi)有誘發(fā)紅斑的作用，同時(shí)空白醇質(zhì)也無(wú)抗炎活性。
　　5、MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ECV304細(xì)胞經(jīng)不同濃度（5ug/L、10ug/L、20ug/L、30ug/L）的雷公藤甲素處理后，培養(yǎng)48小時(shí)后，ECV304細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比均有不同程度的生長(zhǎng)減緩，增殖受到不同程度的抑制。雷公藤甲素在試驗(yàn)濃度（5～30ug/L）內(nèi)對(duì)ECV304細(xì)胞的細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用,在一定范圍內(nèi)呈明顯的濃度依賴性，即隨著藥物

13、濃度的升高而其抑制率也增加。
　　6、光鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)顯示：5ug/L雷公藤甲素處理后，ECV304細(xì)胞鏡下觀察單位面積的細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)輕度的減少。在高濃度（30ug/L）作用后，鏡下ECV304細(xì)胞單位面積的細(xì)胞數(shù)量顯著減少，細(xì)胞間連接變少甚至消失，細(xì)胞間隙增大；細(xì)胞形態(tài)變圓或者外觀形狀不規(guī)則，細(xì)胞體積變小，胞膜呈現(xiàn)皺縮，胞漿減少，細(xì)胞核出現(xiàn)固縮，染色質(zhì)聚集于細(xì)胞壁的邊緣，部分呈月牙樣，有些細(xì)胞裂解成為碎片狀。尤其在高濃度狀態(tài)時(shí)，

14、上述鏡下改變更為明顯。未加雷公藤甲素處理的細(xì)胞無(wú)明顯變化，僅出現(xiàn)少量的細(xì)胞漂浮。
　　7、TRAP-ELISA法分別檢測(cè)經(jīng)不同濃度（5ug/L、10ug/L、20ug/L、30ug/L）處理的雷公藤甲素作用的ECV304細(xì)胞（48小時(shí)）的端粒酶活性。與對(duì)照組相比，各個(gè)處理組均受到明顯的抑制，且隨藥物濃度的增加，抑制作用逐漸增強(qiáng)。各加藥組與對(duì)照組在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異（P<0.01），實(shí)驗(yàn)組（5ug/L、10ug/L、20ug/L、

15、30ug/L）之間亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1、采用薄膜水化法與超聲法結(jié)合技術(shù)制備的醇質(zhì)體，具有包封率高、透皮率好的優(yōu)點(diǎn)，尤其適合脂質(zhì)體藥物載體。
　　2、最優(yōu)化處方顯示，雷公藤甲素醇質(zhì)體制劑在卵磷脂為2％(v/v)、乙醇為45％(v/v)處方配比下，粒徑相對(duì)較?。?0nm左右）、粒徑分布比較均勻、包封率高（達(dá)到了98％）。
　　3、醇質(zhì)體既沒(méi)有誘發(fā)紅斑作用也沒(méi)有抗炎活，雷公藤甲素醇