雷公藤甲素對人乳腺癌干細胞干性的影響與初步機制研究.pdf

1、乳腺癌是女性癌癥患者最常見的一種惡性腫瘤，為我國婦女常見好發(fā)腫瘤之一，發(fā)病率呈上升的趨勢，給婦女的身心健康帶來嚴重威脅。一般來說，治療乳腺癌有效方法是在發(fā)病早期腫瘤未擴散之前進行手術治療，切除患者乳房。但是，晚期患者無法進行手術治療，多采用化療，比如使用阿霉素、紫杉醇、順鉑以及聯(lián)合給藥等。然而，化療時很容易發(fā)生耐藥(Multi-drug Resisitance，MDR)，甚至是化療后腫瘤復發(fā)。因此，開發(fā)有效的臨床藥物進行化療追在眉梢，可

2、以避免患者產生因手術帶來的心理陰影，提高其生活質量。
　　國外很多學者研究表明，腫瘤組織細胞中存在一小群有自我更新能力，且可以無限增殖，具有多向分化潛能的細胞群，這一小群細胞被稱為腫瘤干細胞(Cancer Stem Cells，CSCs)。CSCs是形成分化程度不同的腫瘤細胞以及腫瘤不斷擴大的源頭，很可能是腫瘤發(fā)生、復發(fā)及轉移的根本原因。現(xiàn)今越來越多的研究表明，乳腺癌干細胞(Breast Cancer Stem Cells，BCS

3、Cs)是導致乳腺癌發(fā)生、發(fā)展、復發(fā)及治療抵抗的罪魁禍首，而靶向腫瘤干細胞的藥物則可能減少腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復發(fā)及治療抵抗。
　　雷公藤甲素(Triptolide，Tpl.)是從衛(wèi)矛科植物雷公藤中提取出的一種活性物質，是雷公藤發(fā)揮藥物活性的主要有效成分，在體內化學性質穩(wěn)定。其功效主要為祛風除濕、消腫止痛。藥理研究也表明其還有免疫抑制、抗炎、抗腫瘤等作用。雷公藤甲素廣泛應用于風濕性關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎、腎炎、哮喘、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、皮

4、膚病等多種自身免疫和炎性疾病。
　　一些學者研究成果表明雷公藤甲素可以通過抑制炎癥相關信號通路來調控轉錄因子活性來起到抑制腫瘤的作用。比如，轉錄因子NF-κB活性可被雷公藤甲素抑制。另外一些研究也發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素可影響腫瘤干細胞的生長及其干細胞特性，但研究較多集中在膠質瘤上，而針對乳腺癌干細胞研究未見報道。
　　本文通過一系列體外實驗來評價雷公藤甲素抗乳腺癌干細胞干性作用，并在前人文獻基礎上進一步摸索其分子機制，為擴展雷公藤甲

5、素的臨床應用，以及今后進一步尋找作用高效特異的靶向腫瘤干細胞的抑制劑奠定基礎。
　　一、雷同藤甲素抑制人乳腺癌細胞MCF-7ADM耐藥
　　本實驗部分通過SRB法檢測雷公藤甲素、阿霉素及兩者聯(lián)合對人乳腺癌細胞MCF-7ADM細胞毒作用，此細胞株為耐阿霉素細胞株。
　　實驗結果表明，阿霉素對其半數(shù)抑制濃度IC50值為102.48μM，而雷公藤甲素對其IC50值為0.15μM，兩者聯(lián)合作用時IC50值為6.58μM。說明雷

6、公藤甲素可以明顯抑制MCF-7ADM細胞耐阿霉素作用，并且通過計算兩者聯(lián)合用藥時的聯(lián)合指數(shù)CI值發(fā)現(xiàn)，兩者聯(lián)合給藥具有協(xié)同作用。
　　二、雷公藤甲素對乳腺癌干細胞干性的影響
　　本實驗部分通過流式細胞術分析雷公藤甲素對CD44+/CD24-/low乳腺癌干細胞、側群(Side Population，SP)細胞比例的影響，聯(lián)合克隆形成實驗及劃痕實驗來考察雷公藤甲素對乳腺癌干細胞的干性影響。
　　實驗結果表明，雷公藤甲素可

7、降低SP細胞及CD44+/CD24-low乳腺癌干細胞的比例，推斷其對干細胞殺傷作用強于非干細胞。而且，雷公藤甲素還可以明顯抑制軟瓊脂克隆形成、懸浮培養(yǎng)微球體的生長以及劃痕愈合，說明雷公藤甲素具有一定的靶向乳腺癌干細胞作用特點。
　　三、雷公藤甲素影響乳腺癌干細胞分子機制初步探討
　　本實驗部分通過蛋白免疫印跡(Western Blot，WB)初步檢測不同時間點不同劑量下雷公藤甲素對與腫瘤干細胞相關的Wnt信號通路影響。

8、r>　　檢測雷公藤甲素對β-1，4-半乳糖基轉移酶5(β-1，4-galactosyltransferase5，B4GalT5)表達的影響。
　　并通過RNAi抑制B4GalT5的表達，通過反轉錄PCR(Reverse Transcriptional-PCR，RT-PCR)及WB法檢測B4GalT5干擾效率，流式細胞儀檢測B4GalT5被干擾后SP比例變化，CD44+/CD24-/low乳腺癌干細胞比例變化，以及對劃痕愈合及蛋白糖