雷公藤甲素脂質(zhì)體的制備及質(zhì)量的初步研究.pdf

1、雷公藤甲素(又稱(chēng)雷公藤內(nèi)酯、雷公藤內(nèi)酯醇；或Triptolide，TP)，是中藥雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.F.)中分離出的活性最高的環(huán)氧化二萜內(nèi)酯化合物，雷公藤甲素(TP)在治療各種免疫性疾病、炎性疾病及癌癥方面起了很大作用。但其臨床不良反應(yīng)的發(fā)生頻率高，主要發(fā)生在消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、骨髓和血液系統(tǒng)等。因此，改良雷公藤甲素單體劑型、研究新型給藥系統(tǒng)以降低其毒性具有十分重要的意義

2、。本文是將雷公藤甲素(簡(jiǎn)稱(chēng)TP)制備成為雷公藤甲素脂質(zhì)體(簡(jiǎn)稱(chēng)TP-LP)，以達(dá)到藥物緩釋的目的，為后續(xù)體內(nèi)增效減毒研究奠定基礎(chǔ)。
　　 本文分為三部分：
　　 第一部分：雷公藤甲素脂質(zhì)體的處方前研究。
　　 目的：建立雷公藤甲素脂質(zhì)體的含量測(cè)定方法、測(cè)定雷公藤甲素在PBS中的溶解度及篩選包封率的測(cè)定方法，為雷公藤甲素脂質(zhì)體的制備處方篩選、工藝研究、質(zhì)量研究及體外分析奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：采用紫外-可見(jiàn)

3、全波長(zhǎng)掃描測(cè)定雷公藤甲素和空白脂質(zhì)體的最大吸收峰，確定檢測(cè)波長(zhǎng)。采用紫外分光光度法測(cè)定雷公藤甲素的含量，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；用紫外分光光度法測(cè)定雷公藤甲素在PBS中的溶解度；采用凝膠過(guò)濾法、高速離心法、透析法及超濾離心法這四種方法測(cè)定TP-LP的包封率，考察方法回收率，并以包封率為指標(biāo)，進(jìn)行方法的可行性分析。
　　 結(jié)果：全波長(zhǎng)掃描結(jié)果：空白脂質(zhì)體在202nm有最大吸收，雷公藤甲素在220nm有最大吸收，雷公藤甲素發(fā)生顯色反應(yīng)后在54

4、0nm有最大吸收；繪制雷公藤甲素在0.1539μg/ml～12.467μg/ml濃度范圍和1.3852μg/ml～112μg/ml濃度范圍的標(biāo)準(zhǔn)曲線，濃度與吸光度的線性關(guān)系良好，回歸方程分別為：A=0.0128 C+0.0022(r=0.9984，n=5)和A=0.0097 C+0.02(r=0.998，n=5)；測(cè)定雷公藤甲素在pH7.0 PBS中溶解度約為21.55μg/ml；四種包封率測(cè)定方法對(duì)游離藥物回收率分別為：107.1％、

5、92.2％、107.8％、95.3％，對(duì)脂質(zhì)體回收率分別為較好、不好、較好、好；
　　 結(jié)論：對(duì)結(jié)果分析，雷公藤甲素在220nm處最大吸收與空白脂質(zhì)體于202nm處最大吸收峰相近，在含量測(cè)定中易導(dǎo)致干擾，最終確定540nm作為雷公藤甲素的檢測(cè)波長(zhǎng)；PBS溶解度測(cè)定結(jié)果表明，雷公藤甲素在PBS中有微量溶解，對(duì)包封率測(cè)定方法的篩選提供了一定參考；經(jīng)可行性分析，相對(duì)于其他包封率測(cè)定方法，超濾離心法對(duì)游離藥物和脂質(zhì)體回收率好，因此確定采

6、用超濾離心法測(cè)定雷公藤甲素脂質(zhì)體的包封率。
　　 第二部分雷公藤甲素脂質(zhì)體制備方法篩選及制備工藝的研究。
　　 目的：以包封率為指標(biāo)，篩選TP-LP的最佳制備方法；以脂質(zhì)體粒徑、穩(wěn)定性及包封率為指標(biāo)優(yōu)化TP-LP的制備工藝。
　　 方法：分別采用薄膜分散法、機(jī)械勻漿法、乙醇注入法制備TP-LP，以包封率為衡量指標(biāo)，采用超濾離心法分離脂質(zhì)體和游離藥物，測(cè)定包封率，篩選最佳制備方法；在空白脂質(zhì)體的制備工藝研究中，以空

7、白脂質(zhì)體粒徑和穩(wěn)定性為指標(biāo)，對(duì)制備條件：磷脂與膽固醇比例、氯仿用量及超聲情況進(jìn)行優(yōu)化；在TP-LP制備工藝研究中，以包封率為衡量指標(biāo)，采用正交優(yōu)化方法優(yōu)化影響脂質(zhì)體包封率的三個(gè)制備條件：載藥溫度、藥物與磷脂質(zhì)量比(藥脂比)和載藥時(shí)間，采用超濾離心法分離脂質(zhì)體和游離藥物，紫外分光光度法測(cè)定游離藥物含量，計(jì)算TP-LP的包封率，篩選最佳制備工藝，并驗(yàn)證最佳條件的準(zhǔn)確性。
　　 結(jié)果：制備方法的篩選中，薄膜分散法、機(jī)械勻漿法、乙醇注入

8、法制備TP-LP的包封率分別為：12.7％、14％、13.6％；空白脂質(zhì)體制備工藝研究中，磷脂-膽固醇比為4∶1制備的脂質(zhì)體穩(wěn)定性好；超聲100w/5min處理的脂質(zhì)體粒徑分布好；用20ml氯仿制備的空白脂質(zhì)體粒徑分布較好。TP-LP制備工藝研究中，經(jīng)正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，制備條件：載藥溫度37℃、藥脂比1∶50、載藥時(shí)間60min所制備的雷公藤甲素脂質(zhì)體包封率最高；最后按最佳優(yōu)化條件同時(shí)制備三批TP-LP，測(cè)定其平均包封率為46.4％±0.0

9、295。
　　 結(jié)論：以包封率為指標(biāo)，比較三種制備方法，機(jī)械勻漿法制備的TP-LP包封率較高，經(jīng)可行性分析，該方法簡(jiǎn)單、可重復(fù)性好，因此確定機(jī)械勻漿法制備TP-LP；空白脂質(zhì)體單因素優(yōu)化結(jié)果顯示，制備最佳條件為：磷脂-膽固醇比例為4∶1，超聲100w/5min，氯仿用量20ml；TP-LP制備工藝正交優(yōu)化結(jié)果顯示，最佳制備條件為載藥溫度37℃、藥脂比1∶50、載藥時(shí)間60min。最佳條件重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了正交優(yōu)化方法的準(zhǔn)確性

10、。
　　 第三部分雷公藤甲素脂質(zhì)體的質(zhì)量研究及體外釋藥的初步研究。
　　 目的：對(duì)TP-LP進(jìn)行質(zhì)量研究，為提高TP-LP穩(wěn)定性研究奠定基礎(chǔ)；進(jìn)行TP-LP體外藥效初步研究，為其體內(nèi)藥效研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：按最佳工藝制備TP-LP，用透射電鏡顯微觀察TP-LP形態(tài)，用動(dòng)態(tài)光散射儀測(cè)定粒徑分布，用zeta電位分析儀測(cè)定TP-LP的zeta電位，從以上幾個(gè)指標(biāo)對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)；分別加入不同凍干保護(hù)劑制備T

11、P-LP凍干粉，以脂質(zhì)體凍干粉的外觀、復(fù)水情況及復(fù)水后包封率為衡量指標(biāo)，篩選最佳凍干保護(hù)劑；在體外釋藥實(shí)驗(yàn)，采用透析法分別觀察TP和TP-LP的體外釋藥情況，采用紫外分光光度法測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)的累計(jì)釋藥量；體外藥效實(shí)驗(yàn)，用TP、TP-LP處理經(jīng)PHA活化的人外周血單個(gè)核細(xì)胞，以MTT法為檢測(cè)方法，分別于24h、48h、72h測(cè)定TP、TP-LP抑制T淋巴細(xì)胞增殖的效果。
　　 結(jié)果：最佳優(yōu)化工藝制備的TP-LP，粒徑范圍在40nm

12、～250nm之間，平均粒徑為89.2nm。粒徑對(duì)稱(chēng)分布，分散均勻，zeta電位平均值為-67.55mV，絕對(duì)值大于60mv；凍干粉的制備結(jié)果，5％蔗糖-甘露醇混合物(w∶w=1∶1)作為凍干保護(hù)劑所制備的凍干粉外觀良好，復(fù)水過(guò)程良好，無(wú)肉眼結(jié)晶。相對(duì)于其他保護(hù)劑制備的凍干粉，復(fù)水后的包封率下降程度??；TP-LP的體外釋藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果，44小時(shí)后，脂質(zhì)體中TP全部釋放，而游離TP在3h已完全釋放；體外藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，24hTP-LP抑制T淋