LIN28B調(diào)控人乳腺癌干細(xì)胞干性特征和糖代謝的機(jī)制研究.pdf

1、第一部分:LIN28B維持乳腺癌干細(xì)胞的干性特征的機(jī)制研究
　　研究目的:腫瘤干細(xì)胞是腫瘤組織中數(shù)量極少具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞，既表現(xiàn)出干細(xì)胞的特性又有腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)，是腫瘤耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源。有研究[1]證明CD44high表型的肺癌細(xì)胞比CD44low表型的肺癌細(xì)胞有更強(qiáng)的成球能力和致瘤性，接種300個(gè)CD44high細(xì)胞于NOD/SCID（非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷）小鼠就可以形成腫瘤，而接種3×104個(gè)CD44low

2、細(xì)胞或5×105個(gè)未分離的混合細(xì)胞都不能形成腫瘤。LIN28是一種首先在線蟲C.elegants中發(fā)現(xiàn)的RNA結(jié)合蛋白，在其發(fā)育過程中起重要作用;在哺乳動(dòng)物中LIN28具有結(jié)構(gòu)和功能高度同源的兩種同系物L(fēng)IN28A和LIN28B[2]。已有研究表明LIN28在多種腫瘤中高表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3-5]。 microRNA是一類長度為21～25個(gè)核苷酸的非編碼RNA，通過與靶基因mRNA的3'-UTR結(jié)合對其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[6

3、]。有研究發(fā)現(xiàn)LIN28通過阻止Let-7的加工成熟，影響靶基因的表達(dá)從而對調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝和干性發(fā)揮重要作用[7-9]。已有的研究主要是集中在LIN28通過抑制Let-7的加工成熟發(fā)揮調(diào)控作用，不過LIN28也能調(diào)控其他miRNAs如miR-150[4]。本研究的主要目的是探究LIN28B對乳腺癌干細(xì)胞干性特征的調(diào)控并通過miRNA測序發(fā)現(xiàn)其他受LIN28B調(diào)控的miRNAs并進(jìn)一步研究miRNA對MCF-7腫瘤干細(xì)胞的作用。
　　

4、研究方法:首先檢測惡性程度高的三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞和低轉(zhuǎn)移性MCF-7乳腺癌細(xì)胞干性相關(guān)基因SOX2、OCT4、NANOG和LIN28B的mRNA和蛋白表達(dá)，確定LIN28B在惡性程度不同的乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平。然后在MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染p-CMV6-LIN28B質(zhì)粒瞬時(shí)過表達(dá)LIN28B，通過RNA測序找出差異表達(dá)的miRNAs，并進(jìn)一步通過病毒感染方法在MCF-7細(xì)胞建立穩(wěn)定過表達(dá)LIN28B細(xì)胞系，檢測干性相關(guān)基因

5、mRNA和蛋白的表達(dá)、利用流式細(xì)胞儀檢測CD44highCD24low細(xì)胞比例和通過成球培養(yǎng)比較體外成球能力。最后在MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染該差異表達(dá)的miRNA mimic，檢測CD44highCD24low細(xì)胞比例和比較體外成球能力。
　　研究結(jié)果:
　　1.LIN28B在惡性程度高的MDA-MB-231細(xì)胞表達(dá)顯著增高。
　　2.LIN28B能明顯上調(diào)MCF-7細(xì)胞SOX2、OCT4和NANOG的表達(dá)。
　　3.

6、LIN28B能上調(diào)MCF-7細(xì)胞中CD44highCD24low細(xì)胞比例和促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的體外成球能力。
　　4.MCF-7細(xì)胞過表達(dá)LIN28B后miR-92b-5p表達(dá)上調(diào)，miR-4521、miR-149-3p和miR-92a-1-5p表達(dá)下調(diào)。
　　5.MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-92b-5p mimic后CD44highCD24low細(xì)胞比例增高并且體外成球能力增強(qiáng)。
　　結(jié)論:通過調(diào)控miR-92b-5p

7、的表達(dá)是LIN28B促進(jìn)乳腺癌MCF-7細(xì)胞干性特征的機(jī)制之一。
　　第二部分:LIN28B調(diào)控乳腺癌干細(xì)胞糖代謝的機(jī)制研究
　　研究目的:葡萄糖是細(xì)胞最主要的能量來源，正常細(xì)胞攝取葡萄糖后，在氧氣充足的條件下，通過三羧酸循環(huán)將葡萄糖徹底氧化成CO2和H2O，僅在低氧條件下，細(xì)胞進(jìn)行糖酵解生成乳酸。但與正常細(xì)胞不同的是，腫瘤細(xì)胞不管是在氧氣充足還是低氧條件都以糖酵解的方式提供能量，這就是著名的“Warburg effect”

8、。2012年Hanahan和Weinberg將細(xì)胞能量代謝異?？偨Y(jié)為腫瘤的十大特征之—[46]，近年來腫瘤細(xì)胞的這種特殊的代謝方式重新受到廣泛關(guān)注，其形成的機(jī)制及對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等影響也成為研究的熱點(diǎn)。但是目前關(guān)于腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)的代謝狀態(tài)還不是很清楚，CSCs可以根據(jù)不同的條件對自身的代謝狀態(tài)進(jìn)行調(diào)整，以適應(yīng)環(huán)境的變化。已有研究[47，48]發(fā)現(xiàn)靜息的CSCs細(xì)胞的代謝狀態(tài)對Vermeers

9、ch有重要的調(diào)節(jié)作用，有研究指出糖酵解對維持CSCs的干性至關(guān)重要[49]，Vemeersch等[50]通過對普通卵巢癌細(xì)胞和卵巢癌干細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，這兩類細(xì)胞的代謝表型不同，卵巢癌干細(xì)胞對葡萄糖的依賴程度高于普通卵巢癌細(xì)胞。本課題主要研究人乳腺癌干細(xì)胞的糖代謝狀態(tài)以及LIN28B在該代謝過程中的調(diào)控機(jī)制和糖代謝方式與維持乳腺癌干細(xì)胞的干性特征之間的關(guān)系，為了解腫瘤干細(xì)胞及腫瘤治療提供新思路。
　　研究方法:首先我們利用體外

10、成球培養(yǎng)的方法富集MDA-MB-231細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞并用孔徑70μm細(xì)胞篩過濾細(xì)胞球;然后用細(xì)胞能量代謝分析儀檢測細(xì)胞球和貼壁細(xì)胞中線粒體呼吸功能和糖酵解功能，用western blot檢測糖酵解關(guān)鍵分子PKM2、LDHA和HIF-1α的蛋白表達(dá)。然后使用實(shí)驗(yàn)室已建立的病毒感染方法沉默LIN28B基因的穩(wěn)定MDA-MB-231細(xì)胞系，用細(xì)胞能量代謝分析儀比較對照組和shLIN28B組細(xì)胞的線粒體呼吸功能和糖酵解功能;用TALEN技術(shù)敲

11、除MDA-MB-231細(xì)胞的LIN28B基因，用流式細(xì)胞儀檢測野生型細(xì)胞和LIN28B敲除細(xì)胞對2-NBDG的攝取并比較這兩組細(xì)胞對葡萄糖的攝取。最后用LDHA活性檢測試劑盒檢測細(xì)胞球和貼壁細(xì)胞的LDHA活性;在MDA-MB-231細(xì)胞和H1299細(xì)胞加入LDHA抑制劑oxamate，用CCK8試劑檢測不同濃度oxamate對細(xì)胞活性的影響，通過體外成球培養(yǎng)比較不同濃度oxamate對MDA-MB-231細(xì)胞的體外成球能力。
　　

12、研究結(jié)果:
　　1.乳腺癌干細(xì)胞的有氧糖酵解增強(qiáng)而線粒體的氧化磷酸化被抑制且高表達(dá)糖酵解關(guān)鍵分子PKM2、LDHA和HIF-1α。
　　2.LIN28B能促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞表達(dá)糖酵解關(guān)鍵分子PKM2、LDHA和HIF-1α，使MDA-MB-231細(xì)胞攝取葡萄糖增多。
　　3.LIN28B促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞糖酵解并且抑制線粒體的氧化磷酸化。
　　4.LIN28B能與LDHA和HIF-1α的mRN