雌激素通過(guò)Shh-Gli通路對(duì)乳腺癌干細(xì)胞特性和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　研究雌激素、Sonichedgehog(Shh)/Gli信號(hào)通路對(duì)乳腺癌干細(xì)胞(BCSCs)和細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的作用及其生物學(xué)意義，探討雌激素對(duì)乳腺癌細(xì)胞Shh/Gli通路影響、對(duì)乳腺癌干細(xì)胞干性及EMT的作用，通過(guò)特異性阻斷Shh/Gli信號(hào)通路，觀察對(duì)BCSCs和EMT的影響，探討乳腺癌發(fā)病機(jī)制和新的靶向治療方法。
　　方法：
　　逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)20種乳腺癌細(xì)胞系中雌激

2、素受體(ER)、Shh信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄因子Gli1和BCSCs標(biāo)記物ALDH1的表達(dá)并分析其相關(guān)性;Westernblot和免疫熒光檢測(cè)MCF-7、HCC1428、MDA-MB-231和BT549細(xì)胞系ER的表達(dá);將4種乳腺癌細(xì)胞系分別分為酒精對(duì)照組、10nM雌二醇組和10nM雌二醇+1μM他莫昔芬組，Westernblot和RT-PCR檢測(cè)Gli1表達(dá);MCF-7和HCC1428細(xì)胞系分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒(shVEC)和Gli1干擾質(zhì)粒（shG

3、li1-1和shGli1-2），加入酒精或雌二醇培養(yǎng)，用流式細(xì)胞術(shù)、mammosphere形成和Westernblot檢測(cè)BCSCs干性的改變，劃痕實(shí)驗(yàn)、Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)和Westernblot檢測(cè)對(duì)乳腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響;用不同濃度雌二醇處理乳腺癌細(xì)胞系后，RT-PCR和Westernblot檢測(cè)Gli1、Shh和ALDH1的表達(dá)。免疫組化檢測(cè)組織芯片ER、Gli1和ALDH1表達(dá)并分析相關(guān)性。
　　結(jié)果：

4、　　1.20種乳腺癌細(xì)胞系中ER、Gli1和ALDH1mRNA均表達(dá)，但表達(dá)水平不同，線(xiàn)性分析顯示ER的表達(dá)分別與Gli1和ALDH1呈正相關(guān)(r=0.845，p＜0.01;r=0.385，p＜0.05)。
　　2.用雌二醇處理后，ER陽(yáng)性細(xì)胞系(MCF-7、HCC1428)Gli1蛋白水平較對(duì)照組明顯升高，聯(lián)合他莫昔芬處理后，Gli1表達(dá)降低;在同樣2個(gè)實(shí)驗(yàn)處理組中ER陰性細(xì)胞系（MDA-MB-231、BT549）Gli1表達(dá)無(wú)

5、明顯改變，說(shuō)明雌激素只能在ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞系中激活Shh/Gli1通路。
　　3.MCF-7和HCC1428分別轉(zhuǎn)染shVEC、shGli1-1和shGli1-2，經(jīng)雌二醇處理后，Westernblot和RealtimeRT-PCR檢測(cè)MCF-7和HCC1428細(xì)胞中BCSCs相關(guān)標(biāo)記物ALDH1、Nanog、SOX2和Bmi-1蛋白和mRNA水平的表達(dá)，shVEC細(xì)胞經(jīng)雌二醇處理后ALDH1、Nanog、SOX2和Bmi-1蛋

6、白和mRNA表達(dá)水平明顯升高，shGli1-1和shGli1-2雌二醇處理組與酒精對(duì)照組比較，ALDH1、Nanog、SOX2和Bmi-1蛋白和mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯變化，明顯低于shVEC組（**或＃＃P＜0.01）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表達(dá)具有干細(xì)胞標(biāo)記CD44+/CD24-/low亞型細(xì)胞的比例，shVEC細(xì)胞經(jīng)雌二醇處理后表達(dá)CD44+/CD24-/low的細(xì)胞比例明顯升高，shGli1-1和shGli1-2雌二醇處理組與酒精對(duì)照組比

7、較，CD44+/CD24-/low細(xì)胞比例變化不大，都明顯低于shVEC組（**或＃＃P＜0.01）。相似的結(jié)果也在mammosphere形成實(shí)驗(yàn)得到驗(yàn)證，shVEC細(xì)胞的雌二醇處理組mammosphere的數(shù)量和體積都明顯高于shVEC酒精對(duì)照組，shGli1-1和shGli1-2雌二醇處理組和酒精對(duì)照組mammosphere的數(shù)量和體積無(wú)明顯變化，都明顯低于shVEC組（**或＃＃P＜0.01）。
　　4.隨著雌二醇濃度的增加

8、，Gli1和ALDH1的mRNA和蛋白表達(dá)水平逐漸升高，Shh的表達(dá)無(wú)明顯變化，說(shuō)明在ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞中，雌激素通過(guò)Shh/Gli通路的配體非依賴(lài)的途徑激活Gli1調(diào)控BCSCs（*P＜0.05，**P＜0.01）。
　　5.MCF-7和HCC1428分別轉(zhuǎn)染shVEC、shGli1-1和shGli1-2，shVEC細(xì)胞經(jīng)雌二醇處理后細(xì)胞發(fā)生EMT，其遷移和侵襲能力均增強(qiáng);shGli1-1和shGli1-2雌二醇處理組細(xì)胞不發(fā)生

9、EMT，與酒精對(duì)照組比較遷移和侵襲能力變化不大;與shVEC相比，shGli1-1和shGli1-2細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯下降（**或＃＃P＜0.01）。
　　6.組織芯片檢測(cè)10例正常乳腺組織Gli1和ALDH1低表達(dá)，100例乳腺癌組織中Gli1和ALDH1的表達(dá)升高。線(xiàn)性分析乳腺癌組織ER與Gli1、ALDH1的關(guān)系，顯示ER的表達(dá)分別與Gli1和ALDH1呈正相關(guān)(r=0.713，p＜0.01;r=0.476，p＜0.0