CHIP-EGFR信號(hào)通路調(diào)控胰腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制研究.pdf

1、胰腺癌是預(yù)后最差的惡性腫瘤之一，它具有惡性程度高、早期診斷困難的特點(diǎn)。80％的患者診斷時(shí)腫瘤已為進(jìn)展期，失去了手術(shù)根治的機(jī)會(huì)。轉(zhuǎn)移是制約胰腺癌遠(yuǎn)期生存的重要因素。因此明確胰腺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，對(duì)胰腺癌的治療具有重要意義。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)泛素E3連接酶CHIP可以特異性結(jié)合并降解EGFR。在胰腺癌細(xì)胞中穩(wěn)定過表達(dá)CHIP蛋白可以抑制EGFR的表達(dá)，降低其侵襲和遷移能力。在穩(wěn)定抑制CHIP的胰腺癌細(xì)胞中EGFR的表達(dá)是升高的，侵襲和遷移

2、能力也相應(yīng)增強(qiáng)。CHIP可對(duì)胰腺癌細(xì)胞侵襲和遷移產(chǎn)生影響，但其對(duì)胰腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是否具有調(diào)控作用仍不明確。因此將CHIP/EGFR信號(hào)通路作為本研究的研究對(duì)象，深入研究其對(duì)胰腺癌侵襲、遷移等惡性生物學(xué)行為的影響，驗(yàn)證CHIP是否能通過降解EGFR調(diào)控胰腺癌細(xì)胞EMT，并探索其調(diào)控機(jī)制。
　　目的：1.明確CHIP蛋白調(diào)控胰腺癌細(xì)胞株侵襲、遷移能力是否是通過EGFR信號(hào)通路;
　　2.驗(yàn)證CHIP/EGFR能否

3、介導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞株上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。
　　3.初步探索CHIP/EGFR介導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞株上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制。
　　方法：本研究使用課題組前期構(gòu)建的CHIP穩(wěn)定過表達(dá)或抑制的PANC-1細(xì)胞株。通過脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染EGFR siRNA和EGFR過表達(dá)質(zhì)粒改變細(xì)胞EGFR的表達(dá)，采用real-time PCR法和Western blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。成功轉(zhuǎn)染后，采用劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)改變EGFR表達(dá)情況后CH

4、IP穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的遷移和侵襲能力，明確CHIP是否通過調(diào)控EGFR對(duì)胰腺癌細(xì)胞株侵襲、遷移發(fā)揮調(diào)控作用。隨后，通過Western blot法檢測(cè)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物和EGFR相關(guān)信號(hào)通路，初步探索CHIP/EGFR信號(hào)通路介導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞株上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)機(jī)制。
　　結(jié)果：1.在CHIP蛋白穩(wěn)定抑制的胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1amiRNA中，用siRNA干擾EGFR的表達(dá)，可以逆轉(zhuǎn)EGFR過表達(dá)導(dǎo)致的侵襲、遷移能力增強(qiáng);
　　2

5、.在CHIP蛋白穩(wěn)定過表達(dá)的胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1CHIPOE中，轉(zhuǎn)染EGFR過表達(dá)質(zhì)粒，可以逆轉(zhuǎn)EGFR抑制導(dǎo)致的侵襲、遷移能力減弱;
　　3.在PANC-1amiRNA中，EGFR相對(duì)對(duì)照組高表達(dá)，EMT的標(biāo)志物也發(fā)生變化，上皮表型標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)降低，間質(zhì)表型標(biāo)志物N-cadherin，Vimentin表達(dá)升高，Slug蛋白表達(dá)也升高;在PANC-1CHIPOE中可以得到相反的結(jié)果。
　　4.實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

6、顯示，在PANC-1amiRNA中，用siRNA干擾EGFR的表達(dá)，可抑制EGFR下游的Src/FAK信號(hào)通路，E-cadherin表達(dá)升高，N-cadherin，Vimentin表達(dá)降低，Slug蛋白表達(dá)也降低，逆轉(zhuǎn)了CHIP穩(wěn)定抑制導(dǎo)致的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。在PANC-1CHIPOE中過表達(dá)EGFR，激活了下游的Src/FAK信號(hào)通路，E-cadherin表達(dá)降低，N-cadherin，Vimentin表達(dá)升高，Slug蛋白表達(dá)也升高，發(fā)