USP49-FKBP5-AKT信號通路與胰腺癌耐藥性機制.pdf

1、目的:絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AKT（也被稱為PKB），是細胞生長的中心調控因子。AKT信號參與細胞體內多種信號途徑，具有廣泛的生物學效應，其活性異常不僅能導致細胞惡性轉化，而且與腫瘤細胞的遷移、黏附、血管生成以及細胞外基質的降解等相關，它的超活化導致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及化療耐受。之前的研究表明，磷酸化酶PHLPP能夠對AKT-Ser473位點去磷酸化負調控AKT的活性。FKBP5作為骨架蛋白，可促進PHLPP-AKT蛋白相互作用，并參與

2、PHLPP介導的AKT-Ser473去磷酸化，F(xiàn)KBP5通過調控AKT信號通路中起到了抑制腫瘤發(fā)生的作用。但是，目前關于FKBP5的調控機制還不是很清楚。在本文中，我們主要尋找FKBP5的調控蛋白，研究其對FKBP5的調控機制以及該蛋白是如何通過FKBP5-AKT通路調控腫瘤的生長和對化療藥物的耐受性。
　　方法:(1)通過串聯(lián)親和純化及質譜分析（TAP-MS）尋找FKBP5的互作蛋白。(2)利用病毒感染的方法建立FKBP5互作蛋

3、白的過表達或敲低細胞穩(wěn)定株，免疫印跡法檢測FKBP5的蛋白表達及穩(wěn)定性。(3)利用體內和體外泛素化實驗，檢測目標蛋白對FKBP5的泛素化調控情況。(4)利用病毒感染的方法建立FKBP5及其互作蛋白的單敲低與雙敲低細胞穩(wěn)定株，免疫印跡法檢測AKT及其下游蛋白的磷酸化變化情況。(5)利用MTT實驗、軟瓊脂實驗檢測目標蛋白對胰腺癌細胞生長的影響。(6)建立動物模型，檢測目標蛋白對腫瘤生長的影響。(7)利用免疫組化技術檢測FKBP5、P473-

4、AKT和目標蛋白在組織芯片中的表達情況。(8)檢測目標蛋白如何影響胰腺癌細胞對化療藥物的敏感性。
　　結果:(1)運用串聯(lián)親和純化及質譜分析發(fā)現(xiàn)了FKBP5的互作蛋白去泛素化酶USP49，并利用免疫共沉淀實驗驗證了二者的相互作用。(2)敲低USP49能夠下調FKBP5的蛋白水平，F(xiàn)KBP5的蛋白穩(wěn)定性也隨之降低。(3)敲低USP49增加FKBP5的泛素化水平，過表達USP49則降低FKBP5的泛素化水平。(4)穩(wěn)定敲低USP49后

5、，AKT及下游蛋白的磷酸化水平增加。但是在敲低FKBP5的基礎上再敲低USP49，AKT及下游蛋白的磷酸化平便不再變化。(5)穩(wěn)定敲低USP49能夠促進胰腺癌細胞的增殖;但是在敲低FKBP5的基礎上再敲低USP49，則不再進一步促進;(6)體內實驗表明，穩(wěn)定敲低USP49能夠促進小鼠腫瘤的生長;在敲低USP49基礎上再過表達FKBP5，腫瘤的生長能力又恢復正常。(7)免疫組化結果表明，USP49與FKBP5在胰腺癌組織中表達呈正相關，而

6、USP49和P473-AKT表達呈負相關。(8) USP49能夠增加胰腺癌細胞對化療藥物的敏感性。
　　結論:本文發(fā)現(xiàn)去泛素化酶USP49，作為一個新的AKT信號通路調控因子，能夠去泛素化穩(wěn)定FKBP5，加強PHLPP介導的AKT的去磷酸化調節(jié)。此外，USP49能夠抑制胰腺癌細胞增殖，促進胰腺癌細胞對化療藥物的敏感性。臨床上，USP49在胰腺癌組織樣本中低表達，且與FKBP5表達呈正相關而與AKT-Ser473磷酸化的表達呈負相關