EGFL7通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)胰腺癌侵襲的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分 EGFL7在人胰腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)
　　目的:研究Patu8988、PANC-1、BxPC-3、Capan-1胰腺癌細(xì)胞EGFL7的表達(dá)狀況，為后續(xù)研究做好準(zhǔn)備。
　　方法:常規(guī)培養(yǎng)Patu8988、PANC-1、BxPC-3、Capan-1胰腺癌細(xì)胞，Real-time PCR、Western blot方法檢測(cè)EGFL7 mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:Real-time PCR顯示上述4株胰腺癌細(xì)胞中E

2、GFL7 mRNA相對(duì)量分別為：1.73±0.15、2.26±0.20、1.53±0.10、1.00±0.10，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Western blot顯示上述4株胰腺癌細(xì)胞中EGFL7蛋白相對(duì)量分別為：0.26±0.03、0.32±0.04、0.23±0.02、0.15±0.02，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中PACN-1細(xì)胞的EGFL7表達(dá)量最高。
　　結(jié)論:在Patu8988、PANC-1、BxPC

3、-3、Capan-1胰腺癌細(xì)胞中，PANC-1細(xì)胞EGFL7表達(dá)量最高。
　　第二部分靶向EGFL7的siRNA干擾質(zhì)粒的構(gòu)建與篩選
　　目的:構(gòu)建并篩選靶向EGFL7沉默效果最佳的siRNA干擾質(zhì)粒。
　　方法:根據(jù)GenBank中EGFL7的基因序列，設(shè)計(jì)4條靶向人EGFL7的siRNA序列，與干擾載體共轉(zhuǎn)染PANC-1細(xì)胞，Real-time PCR、Western blot篩選出最佳干擾序列。
　　結(jié)果:

4、靶向EGFL7基因重組siRNA干擾質(zhì)粒構(gòu)建成功，并能有效抑制EGFL7的表達(dá)，且EGFL7-siRNA-1效果最佳。
　　結(jié)論: EGFL7-siRNA-1干擾質(zhì)粒對(duì)PANC-1細(xì)胞EGFL7的沉默效果最佳。
　　第三部分EGFL7對(duì)胰腺癌PANC-1細(xì)胞侵襲的影響及機(jī)制探討.
　　目的:研究EGFL7靶向沉默后人胰腺癌PANC-1細(xì)胞侵襲能力的改變，及EMT相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的改變。
　　方法:實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為PAN

5、C-1（空白對(duì)照組）、NC-PANC-1（陰性對(duì)照組）、si-PANC-1（實(shí)驗(yàn)組）三組。各組細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)120h，分別在轉(zhuǎn)染24h、48h、72h、96h、120h后MTT法檢測(cè)增殖活性。轉(zhuǎn)染后72h，Transwell檢測(cè)各組細(xì)胞的侵襲能力。Real-timePCR、Western blot檢測(cè)E-Cadherin、N-Cadherin、Fibronectin、Vimentin mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:MTT實(shí)驗(yàn)顯示

6、，轉(zhuǎn)染24h、48h、72h、96h、120h后3組細(xì)胞的增殖活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)染后72小時(shí)3組的侵襲細(xì)胞數(shù)分別為79±5.0、70.2±4.0、30±2.5，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Real-time PCR和Western blot顯示：si-PANC-1組E-Cadherin mRNA及蛋白較其他兩組顯著升高(P<0.05)，而N-Cadherin、Fibronect