轉(zhuǎn)錄因子Gli1在乳腺癌細胞從雌激素依賴性向非依賴性轉(zhuǎn)化中的作用及機制.pdf

1、乳腺癌是雌激素依賴性的腫瘤，雌激素可通過雌激素受體-α (EstrogenReceptor-α，ERα)的介導促進乳腺癌細胞的增殖。阻斷雌激素對乳腺癌細胞的促增殖作用的內(nèi)分泌治療包括使用ER拮抗劑等藥物能夠抑制腫瘤細胞增殖，并誘導其凋亡。而乳腺癌細胞從雌激素依賴性生長轉(zhuǎn)化為非依賴性生長是內(nèi)分泌治療失敗，患者死亡的重要原因。但其發(fā)生機制尚不十分清楚。 Hedgehog(Hh)/Gli信號通路在胚胎發(fā)育中起著極其重要的作用，該通路的

2、異?？稍斐啥喾N先天畸形。越來越多的研究也表明Hh/Gli信號通路的異常激活會引起包括前列腺、胰腺、皮膚、小腦和消化道等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Hh信號通路是通過分泌蛋白Hh與細胞膜上的受體Patch1蛋白結(jié)合后，解除Patch1對另一膜蛋白Smoothed(Smo)的抑制，進而激活細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導通路，調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子Gli蛋白家族的表達和活性，使得信號最終通過對靶基因的組織細胞的特異性轉(zhuǎn)錄而實現(xiàn)。Hh信號通路的異常激活引起的腫瘤，都存在有Gl

3、i轉(zhuǎn)錄因子的高水平表達。但關(guān)于Gli蛋白本身在腫瘤中的作用及其以何種機制參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展的研究尚處于初步研究階段。 Gli蛋白是Hh信號通路的最下游的轉(zhuǎn)錄因子，其家族在脊椎動物中由Gli1、Gli2和Gli3這3種蛋白組成，均可定位于胞質(zhì)和胞核，DNA結(jié)合域由五個鋅指蛋白結(jié)構(gòu)所構(gòu)成。Gli1蛋白直接就是轉(zhuǎn)錄激活子，而其本身又僅是Gli家族的靶基因，因而Gli1的mRNA的表達即是Hh/Gli信號通路激活的一個標志。在小鼠體內(nèi)誘

4、導過表達Gli1均可產(chǎn)生基底細胞癌樣(basalcell carcinoma，BCC)病變。Gli1在許多人類成神經(jīng)管細胞瘤、前列腺癌等中高表達。Gli1的表達可使低轉(zhuǎn)移性的前腺癌細胞株轉(zhuǎn)化成高轉(zhuǎn)移性的細胞，表明Gli1可調(diào)控腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。使用Gli1的siRNA(小片段干擾RNA)阻斷人原代前列腺癌細胞中的Gli1的表達可抑制細胞的增殖已知Hh/Gli通路參與了乳腺的正常發(fā)育，近期有數(shù)篇文獻報道了乳腺癌組織和細胞中Hh/Gli通路中

5、通路成員的表達情況，結(jié)果顯示在60％以上的癌組織中有Gli1等成員的表達增多，在部分乳腺癌細胞株中用環(huán)杷明(cyclopamine)阻斷阻斷該信號通路的活性，不僅可抑制Gli1表達，而且還可以抑制細胞的增殖。目前尚不清楚Gli1本身對乳腺癌細胞增殖的直接作用，亦沒有發(fā)現(xiàn)Gli1在乳腺癌細胞向雌激素非依賴性生長轉(zhuǎn)化中作用方面的研究報道。 為研究Gli1本身對乳腺癌細胞增殖和進展的影響，我們首先觀察了在4株乳腺癌細胞中Patch1(

6、Hh的受體)和Gli1的表達情況，結(jié)果顯示Gli1的表達水平在雌激素非依賴性乳腺癌細胞(MDA-MB-231和MDAMB-435)中遠高于雌激素依賴性乳腺癌細胞(MCF-7和T47D)，并且二者的表達水平與ER的表達呈負相關(guān)。在此基礎(chǔ)上，我們作了以下工作： 1．建立了穩(wěn)轉(zhuǎn)Gli1表達載體的MCF-7細胞系，并用實時定量RT-PCR(Quantitative Real-time PCR，QRT)的方法從中篩選了兩個高表達Gli1的

7、細胞克隆，其中Gli1-clonel和Gli1-clone2的Gli1的表達水平分別為空載對照細胞(穩(wěn)轉(zhuǎn)了空載體pcDNA3.1的細胞)的12和6倍。 2．用流式細胞儀檢測細胞周期觀察了在沒有雌激素刺激的條件下，Gli1的持續(xù)性過表達對細胞增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Gli1-MCF-7細胞的G1期減少，S期增多，細胞周期進程明顯加快。其中Gli1-clonel和Gli1-clone2的S期細胞的比例分別為與空載對照細胞的2.3和1.7

8、倍，表明Gli1的高表達能明顯促進乳腺癌細胞雌激素非依賴性增殖。 3．MCF-7細胞是雌激素依賴性細胞系，我們進一步觀察了在ER激動劑或ER拮抗劑處理下，Gli1過表達對細胞增殖和成瘤的影響。實驗顯示，空載體對照細胞對雌激素類試劑的處理有很高的反應(yīng)性，ER激動劑能明顯促進其增殖，而ER拮抗劑能明顯抑制其增殖；而Gli1高表達的細胞對ER激動劑的增殖促進和對ER拮抗劑的增殖抑制的反應(yīng)性明顯減弱。裸鼠實驗中，在補充雌激素條件下，與對

9、照細胞相比，Gli1-clonel細胞在裸鼠中形成的移植瘤體積明顯增大。當裸鼠移植瘤長到160mm<'3>時，停止補充雌激素，給予他莫西芬(TAM)或豆油(空載對照)皮下注射，之后對照細胞pcDNA3.1-MCF-7的移植瘤體積逐漸縮小，而Gli1-clone1移植瘤體積繼續(xù)增大，表明Gli1還可降低乳腺癌細胞對內(nèi)分泌治療的反應(yīng)性。以上結(jié)果說明Gli1可能參與了乳腺癌細胞從雌激素依賴性生長向雌激素非依賴性生長的轉(zhuǎn)化和乳腺癌細胞對內(nèi)分泌治

10、療抵抗的發(fā)生。 4．在探討Gli1減弱MCF-7細胞對ER激動劑和拮抗劑生長反應(yīng)性的機制中，我們發(fā)現(xiàn)Gli1持續(xù)性高表達的MCF-7細胞克隆中ERα和PR的表達與對照細胞相比，分別降低了約50％和70％；用報告基因方法發(fā)現(xiàn)瞬轉(zhuǎn)的Gli1可將ERα的轉(zhuǎn)錄活性降低約50％，我們還發(fā)現(xiàn)瞬轉(zhuǎn)Gli1可以使細胞NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性升高。 5．我們的實驗還表明MCF-7細胞中ERα的過表達能促進Gli1的表達和轉(zhuǎn)錄活性，表明在乳腺

11、癌細胞中存在Gli1和ERα的相互作用。 以上結(jié)果表明Gli1表達增多可以明顯促進乳腺癌細胞雌激素非依賴性的增殖，并減弱乳腺癌細胞對ER激動劑和拮抗劑生長反應(yīng)性，提示Gli1在乳腺癌向雌激素非依賴性生長轉(zhuǎn)化和在腫瘤對內(nèi)分泌治療的抵抗中具有重要作用。Gli1的上述作用可能與其降低ERα和PR表達、抑制ERα的轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)，Gli1誘導的NF-κB的活性的增高可能也參與了這個過程。同時ERα可促進Gli1的表達和活性，表明在乳腺癌細