NF-κB和PPAR-γ交叉對(duì)話調(diào)控LDL穿胞及其在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用.pdf

1、目的:高脂血癥是動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)發(fā)生發(fā)展的主要危險(xiǎn)因素之一,其中低密度脂蛋白(LDL)在內(nèi)皮細(xì)胞下的滯留被認(rèn)為是AS的始發(fā)因素,而LDL在血管內(nèi)皮細(xì)胞下的滯留主要通過(guò)在血管內(nèi)皮細(xì)胞中穿胞(transcytosis)實(shí)現(xiàn)。TNF-α是已知能促AS形成與發(fā)展的重要炎癥介質(zhì),但其促AS發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制尚未闡明。在本論文中,我們首先建立體外穿胞模型,觀察TNF-α對(duì)LDL在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)中

2、穿胞的影響及對(duì)AS發(fā)生發(fā)展的影響,并進(jìn)一步探討與TNF-α密切相關(guān)的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)和過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)在該過(guò)程中的作用。
　　方法:通過(guò)transwell嵌套培養(yǎng)技術(shù),用FITC標(biāo)記LDL,將含有6倍濃度未標(biāo)記的LDL作為競(jìng)爭(zhēng)組,通過(guò)熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)transwell小室下層液體的熒光密度,并計(jì)算其差值來(lái)建立HUVECs體外LDL穿胞模型。用建立的體外穿胞模型檢測(cè)穿胞抑制劑,NF-κ

3、B抑制劑以及PPAR-γ抑制劑對(duì)TNF-α所引起穿胞的影響;激光共聚焦方法檢測(cè)LDL在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的攝取量以及在人臍靜脈血管壁的滯留量;在ApoE-/-小鼠,用油紅O染色檢測(cè)主動(dòng)脈根部斑塊的形成,用免疫組化方法檢測(cè)斑塊處CD154信號(hào)的表達(dá)情況。用基于ELISA轉(zhuǎn)錄因子活性測(cè)定方法檢測(cè)總蛋白中NF-κB和PPAR-γ的活性;WesternBlot方法檢測(cè)LDL穿胞相關(guān)蛋白LDLR,caveolin-1和caveolin-2的表達(dá)。

4、
　　結(jié)果:本文在HUVECs中成功建立了LDL體外穿胞的模型,且發(fā)現(xiàn)其具有濃度依賴性。當(dāng)LDL的濃度從50μg/ml增加到100μg/ml時(shí),LDL穿胞量顯著增加,表明LDL的穿胞具有明顯的濃度依賴性。在建立的體外穿胞模型中發(fā)現(xiàn),TNF-α能夠增加LDL在內(nèi)皮細(xì)胞中的穿胞,而且該作用不僅能被穿胞抑制劑NEM和M-β-CD(MCD)所阻斷,而且也能被NF-κB抑制劑Bay-11-7082(Bay)和(PDTC)以及PPAR-γ的抑

5、制劑GW9662,T0070907(T007)所降低。同樣,在激光共聚焦實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),穿胞抑制劑NEM和MCD,NF-κB和PPAR-γ的抑制劑也能減少TNF-α引起的LDL顆粒在內(nèi)皮細(xì)胞中的攝取以及血管壁的滯留。在ApoE-/-小鼠,我們發(fā)現(xiàn)注射TNF-α能加速血管壁AS斑塊的形成,且TNF-α促進(jìn)早期AS斑塊形成的作用不僅能被NEM和MCD這兩個(gè)穿胞抑制劑所抑制,而且也能被NF-κB抑制劑PDTC,PPAR-γ抑制劑GW9662所抑制

6、。我們進(jìn)一步研究了CD40配體CD154的表達(dá),其參加早期AS的形成,結(jié)果表明NF-κB和PPAR-γ抑制劑能阻止斑塊處CD154的表達(dá)。用基于ELISA的轉(zhuǎn)錄因子活性測(cè)定方法發(fā)現(xiàn),TNF-α不僅能夠增加NF-κB活性,也能夠增加PPAR-γ的活性;NF-κB抑制劑Bay和PDTC不僅抑制NF-κB活性,也能抑制PPAR-γ的活性。同樣,PPAR-γ的抑制劑GW9662,T007不僅能逆轉(zhuǎn)TNF-α引起的PPAR-γ活性的增加,也能在一

7、定程度上抑制TNF-α引起的NF-κB活性的增加。采用交叉結(jié)合試驗(yàn)進(jìn)一步探討NF-κB和PPAR-γ兩者之間的相互作用,給予TNF-α刺激后形成的活性轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物既包含NF-κBP65亞基,也包括PPAR-γ,且該復(fù)合體不僅結(jié)合NF-κB反應(yīng)元件(KBRE),也結(jié)合PPAR-γ反應(yīng)元件(PPRE)。在用Western Blot方法檢測(cè)LDL穿胞相關(guān)蛋白中,TNF-α能夠增加低密度脂蛋白受體LDLR,小凹蛋白caveolin-1,cav

8、eolin-2的表達(dá),且該作用既能被NF-κB抑制劑所阻斷,也能被PPAR-γ抑制劑所拮抗。
　　結(jié)論:LDL穿胞具有濃度依賴性,給臨床上高脂血癥促發(fā)AS提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。TNF-α可通過(guò)直接刺激LDL在血管內(nèi)皮細(xì)胞穿胞、增加LDL在血管壁滯留進(jìn)而促進(jìn)AS的形成。在該過(guò)程中,NF-κB和PPAR-γ兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子均被激活并且交叉對(duì)話,相互結(jié)合形成活性復(fù)合物,從而促進(jìn)LDL穿胞相關(guān)蛋白包括LDLR,Caveolin-1,-2的轉(zhuǎn)錄