Hepal-6細胞熱休克后裂解蛋白致敏BMDCs瘤苗抗腫瘤免疫效應(yīng)的研究.pdf

1、腫瘤微環(huán)境是腫瘤逃避免疫排斥和促進腫瘤發(fā)生和發(fā)展的一個重要保護屏障，也是腫瘤免疫治療的一個瓶頸。腫瘤微環(huán)境構(gòu)成一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò):①腫瘤MHC、HLA、Fas分子、TSA、TAA等的表達改變或缺失;②腫瘤上調(diào)分泌IL-10、TGF-β1等免疫抑制細胞因子，下調(diào)分泌IL-2、IFN-γ等免疫效應(yīng)細胞因子;③免疫抑制功能的調(diào)節(jié)T細胞(Tregs)在瘤內(nèi)浸潤增多④樹突狀細胞(DCs)功能不全或處于未成熟狀態(tài)⑤熱休克蛋白(HSPs)表達異常。Tre

2、gs的免疫抑制、DCs功能不全、HSPs異常表達對腫瘤微環(huán)境有重要的影響作用:1）Tregs特別是CD4+ CD25+ Foxp3+ Tregs浸潤增多促進腫瘤免疫抑制。叉頭轉(zhuǎn)錄因子p3(Foxp3)在Tregs的活化與功能起到關(guān)鍵的作用，腫瘤分泌的細胞因子TGF-β、IL-10促進CD4+ CD25+ Foxp3+ Tregs在腫瘤浸潤:TGF-β誘導(dǎo)和維持CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg的抑制功能，誘導(dǎo)周圍淋巴器官CD4

3、+ CD25-T細胞反轉(zhuǎn)為抑制型CD4+ CD25+T細胞;IL-10誘導(dǎo)CD4+ CD25+ Foxp3+ Tregs增殖。CD4+ CD25+ Foxp3+Tregs通過細胞直接接觸或分泌細胞因子①抑制CD4+T細胞、CD8+T的活化、增殖;②抑制B細胞的增殖、抗體產(chǎn)生和類型轉(zhuǎn)換，③抑制NK細胞、NK T細胞的細胞毒性，④抑制DCs的成熟。2）腫瘤浸潤的DCs，大部分為未成熟DCs(iDCs):①抗原呈遞能力低;②與CD4+ CD2

4、5+ Foxp3+ Tregs相互作用抑制免疫;③下調(diào)表達共刺激分子CD80、CD86;④上調(diào)表達ICOS、ILT3、ILT4與T細胞相應(yīng)受體結(jié)合誘導(dǎo)初始T淋巴細胞轉(zhuǎn)變?yōu)門regs。3）腫瘤上調(diào)表達HSPs通過細胞保護和抑制調(diào)亡影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　DCs是體內(nèi)最有效的專職抗原遞呈細胞，具有攝取、加工抗原，以MHC-Ⅰ、Ⅱ類肽結(jié)合的形式提呈抗原的能力。用不同的方式刺激DCs制成腫瘤疫苗已證實有抗腫瘤效應(yīng)，本課題利

5、用Hepal-6細胞裂解蛋白的全抗原性，結(jié)合熱休克后提高HSPs表達，增強其免疫性。Hepal-6細胞熱休克后提取蛋白致敏骨髓樹突狀細胞(BMDCs)制成瘤苗，體外研究瘤苗的抗腫瘤效應(yīng);將瘤苗注射荷瘤小鼠，觀察瘤苗的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)。
　　主要方法和實驗路線：
　　1.建立荷瘤小鼠模型，分離和鑒定小鼠脾、淋巴結(jié)和腫瘤內(nèi)CD4+CD25+ Foxp3+ Tregs，F(xiàn)ACS分析瘤內(nèi)CD11c+細胞、CCR7+細胞、CD80+細胞

6、，CD86+細胞的浸潤。免疫組化(IHC)和western-bolt分析腫瘤內(nèi)Foxp3、HSP70和HSP90的表達情況;Hep-6細胞熱休克并提取蛋白。
　　2.培養(yǎng)、誘導(dǎo)和鑒定C57BL/6J小鼠的BMDCs，并做成熟刺激實驗;Hepal-6細胞熱休克后裂解蛋白致敏BMDCs，分析刺激后BMDCs的CD11c、CCR7、CD80、CD86表達，IFN-γ的分泌，體外對T細胞的增殖效應(yīng)和CTL作用，以及對Hepa-6細胞凋亡的

7、影響。
　　3.Hepal-6細胞熱休克后裂解蛋白致敏的BMDCs瘤苗足墊和瘤內(nèi)注射荷瘤小鼠，研究瘤苗對腫瘤的生長抑制;對瘤內(nèi)免疫效應(yīng)CD4+T細胞、CD8+T細胞活化和增殖效應(yīng);對CD11c+細胞、CCR7+細胞、CD80+細胞，CD86+細胞和CD4+ CD25+ Foxp3+ Tregs浸潤的影響;對瘤內(nèi)免效應(yīng)細胞因子和免疫抑制因子的影響;治療后腫瘤組織內(nèi)HSPs分子的表達改變。
　　主要結(jié)果：
　　1.FACS

8、檢測結(jié)果顯示，小鼠瘤內(nèi)有較多的CD25+ Foxp3+ Tregs浸潤，荷瘤小鼠脾和淋巴結(jié)的Foxp3+ Tregs浸潤增多;瘤內(nèi)有CD11c+細胞、CCR7+細胞、CD80+細胞，CD86+細胞浸潤;IHC和western-bolt檢測結(jié)果示，瘤體內(nèi)表達HSP70、HSP90、Foxp3+蛋白。Hepal-6細胞熱休克后，能上調(diào)表達HSP70。
　　2.GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)的BMDCs具有DCs表型，表達CD11c、CCR

9、7、CD80、CD86等DCs相關(guān)分子;Hepal-6細胞熱休克后裂解蛋白致敏的BMDCs上調(diào)表達CD11c、CCR7、CD80、CD86。
　　3.Hepal-6細胞熱休克后裂解蛋白致敏的BMDCs上調(diào)IFN-γ的分泌，向SLC趨化遷移的能力提高;體外能刺激T細胞的增殖，能促進T細胞的CTL效應(yīng);能促進Hepal-6細胞的凋亡。
　　4.Hepal-6細胞熱休克后裂解蛋白致敏的BMDCs瘤內(nèi)和足墊注射荷瘤小鼠后，平均瘤體體

10、積和重量低于對照組;CD8+T細胞和CD4+T細胞在脾、淋巴結(jié)和腫瘤的浸潤增多，瘤內(nèi)CD11c+細胞、CCR7+細胞、CD80+細胞，CD86+細胞數(shù)量上升;腫瘤、脾、淋巴結(jié)內(nèi)CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg浸潤減少;腫瘤、脾、和淋巴結(jié)Foxp3分子表達下調(diào);腫瘤內(nèi)免疫抑制因子IL-I0、 TGF-β1分泌下調(diào);免疫效應(yīng)因子IL-2、IFN-γ分泌上調(diào);初步檢測的結(jié)果顯示瘤內(nèi)HSP70在治療前后改變不明顯。
　　結(jié)論：

11、
　　熱休克能提高Hepal-6細胞HSPs表達，裂解蛋白體外致敏的BMDCs上調(diào)表達CD11c、CCR7、CD80、CD86分子;上調(diào)IFN-γ的分泌，遷移能力增強。裂解蛋白致敏的BMDCs體外能刺激T細胞的增殖，增強T細胞的CTL效應(yīng)，對Hepal-6細胞的凋亡有促進作用。致敏的BMDCs疫苗瘤內(nèi)注射后，能抑制腫瘤的生長;抑制免疫抑制細胞CD4+ CD25+ Foxp3+ Tregs在腫瘤、脾和淋巴結(jié)的浸潤;下調(diào)免疫抑制細胞因

12、子IL-10、TGF-β在腫瘤的分泌，上調(diào)免疫效應(yīng)細胞因子IL-2、IFN-γ的分泌;促進CD11c+ DCs在瘤內(nèi)浸潤和成熟，促進CD4+T細胞、CD8+T細胞在脾、淋巴、腫瘤結(jié)內(nèi)浸潤。因此，Hepal-6熱休克后裂解蛋白致敏的BMDCs瘤苗能優(yōu)化腫瘤微環(huán)境的T細胞種群，促進瘤內(nèi)CD11+c DCs的浸潤和成熟，改善微環(huán)境的免疫條件，促進腫瘤的免疫排斥，但是否對瘤內(nèi)HSPs的表達有影響尚待實驗進一步研究。
　　創(chuàng)新點：
　

13、　本研究的創(chuàng)新之處在于，利用腫瘤細胞裂解蛋白的全抗原，通過熱休克提高HSPs的表達，提高腫瘤細胞免疫原性;提高BMDCs抗原遞呈;減少免疫抑制細胞Tregs的浸潤;促進CD4+T細胞、CD8+T細胞和NK T細胞的活化和增殖;促進免疫效應(yīng)細胞因子的分泌;抑制免疫抑制因子的分泌。
　　問題和展望：
　　由于HSPs在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中扮有重要角色，本研究通過熱休克提高腫瘤細胞HSPs表達，熱休克后提取的蛋白能促