基于survivin的新型“模擬病毒”瘤苗的分子設(shè)計(jì)及抗腫瘤免疫的研究.pdf

1、惡性腫瘤是世界上致死率最高的疾病之一，由于大多數(shù)的惡性腫瘤在診斷早期就發(fā)生了微轉(zhuǎn)移，所以當(dāng)前基于手術(shù)切除、化療、放療的治療方案仍然不能完全控制其復(fù)發(fā)率。因此，尋找新的輔助治療方法迫在眉睫。近年來，以激活細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)為主的免疫治療策略在惡性腫瘤的綜合治療中發(fā)揮了重要作用。與其它傳統(tǒng)的治療方法相比較，免疫治療能誘導(dǎo)自身的腫瘤特異性免疫應(yīng)答，不但可以識別和清除腫瘤細(xì)胞，而且還可以誘

2、發(fā)免疫記憶，阻止腫瘤的復(fù)發(fā)。 Survivin是1997年發(fā)現(xiàn)的凋亡蛋白抑制因子家族(inhibitor of apoptosis protein，IAP)的一個重要成員。研究表明：(1)該蛋白是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡抑制因子，具有抑制細(xì)胞凋亡和維持細(xì)胞有絲分裂的雙重功能。Survivin過度表達(dá)能顯著抑制由各種刺激所誘導(dǎo)的凋亡，而下調(diào)survivin的表達(dá)則顯著增加細(xì)胞凋亡指數(shù)并導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂障礙；(2)Survivin在

3、正常的終末分化組織中幾乎不表達(dá)，但在幾乎所有被研究的惡性腫瘤組織中呈陽性表達(dá)，如結(jié)腸癌(>80％)、乳腺癌(70％-98％)、胰腺癌(88％)、胃癌(>60％)、食道癌(80％)、肝癌(70％)等常見腫瘤均高表達(dá)survivin，故該蛋白被視為最具腫瘤特異性的腫瘤共享抗原；(3)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，survivin表達(dá)水平與腫瘤惡性程度成正相關(guān)；如果腫瘤組織高表達(dá)survivin，腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)下降，對放化療的耐受性增強(qiáng)、預(yù)后差。相反，如果腫

4、瘤組織低表達(dá)或不表達(dá)survivin，通常對放化療敏感、預(yù)后良好。故該蛋白被視為最具腫瘤特異性的治療靶標(biāo)。 另外在許多抗腫瘤研究中，將IL-15作為免疫佐劑，可以上調(diào)T細(xì)胞Bcl-2和Bcl-xl的表達(dá)，增強(qiáng)效應(yīng)細(xì)胞抗凋亡能力，成功地誘導(dǎo)出長效的抗原特異性的記憶性CTL，對抗腫瘤發(fā)揮了重要作用。因此，本研究基于以往的基礎(chǔ)，將陽離子穿膜肽HIV-Tat<,49-57>與來源于survivin的H2-k<'d>限制性CTL表位肽su

5、rvivin<,85-93>設(shè)計(jì)成融合肽的形式，利用正負(fù)電荷吸引原理，以富含正電荷的陽離子融合肽包裝富含負(fù)電荷的IL-15 DNA佐劑，形成模擬天然病毒結(jié)構(gòu)的瘤苗形式，故我們將這種形式的疫苗命名為“模擬病毒”瘤苗。 我們希望該“模擬病毒”瘤苗能將所攜帶的腫瘤抗原表位肽在體內(nèi)有效地激發(fā)CTL應(yīng)答，達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)，從而抑制腫瘤的生長。研究發(fā)現(xiàn)，在適當(dāng)NaCl濃度的溶液中，一定比例的融合肽與DNA能產(chǎn)生小而均勻的顆粒性肽-DN

6、A復(fù)合物，是一種類似于病毒的結(jié)構(gòu)，使腫瘤抗原多肽的免疫原性和DNA的佐劑效應(yīng)有效結(jié)合，形成很好的復(fù)合物，避免了酶的降解，使得該疫苗在體內(nèi)具有很好的穩(wěn)定性。細(xì)胞轉(zhuǎn)染和抗原呈遞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，“模擬病毒”瘤苗能有效轉(zhuǎn)染細(xì)胞，表達(dá)所攜帶的基因，并成功呈遞抗原表位肽。 在Babl/c小鼠動物模型中，我們用“模擬病毒”瘤苗免疫動物，可誘導(dǎo)產(chǎn)生CTL活性，而且能促進(jìn)CTL分泌IFN-γ。含IL-15質(zhì)粒的“模擬病毒”瘤苗比含空質(zhì)粒的“模擬病毒

7、”瘤苗激發(fā)出更多分泌IFN-γ的CTL，而PBS刺激組不能激發(fā)分泌IFN-γ的CTL。在細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)中，含IL-15質(zhì)粒的“模擬病毒”瘤苗激發(fā)出的CTL的殺傷活性最高，明顯高于含空質(zhì)粒的“模擬病毒”瘤苗激發(fā)出的CTL殺傷活性，而PBS刺激組不能激發(fā)具有細(xì)胞毒活性的CTL。這些結(jié)果均提示，含IL-15質(zhì)粒的“模擬病毒”瘤苗能在體內(nèi)有效激發(fā)CTL，并高效特異地殺傷結(jié)腸癌CT26靶細(xì)胞。為了進(jìn)一步評價“模擬病毒”瘤苗在體內(nèi)的抗瘤效應(yīng)，我們采用B

8、abl/c小鼠的荷瘤模型，腫瘤采用結(jié)腸癌細(xì)胞CT26。研究結(jié)果證實(shí)，含有IL-15的“模擬病毒”瘤苗免疫組中小鼠的腫瘤生長速度明顯低于對照組，而且生存率也相應(yīng)提高。結(jié)果提示，含有IL-15的“模擬病毒”瘤苗能在體內(nèi)有效抑制腫瘤的生長，起到較好的保護(hù)作用。 綜上所述，為了尋求新型的腫瘤免疫治療策略，本研究以survivin為靶分子，構(gòu)建了基于survivin的新型“模擬病毒”瘤苗，并對該瘤苗進(jìn)行了的抗瘤機(jī)制和效應(yīng)的研究。研究在體外

9、制備基于survivin的新型“模擬病毒”瘤苗；用掃描電鏡和免疫印跡(Western blot)進(jìn)行鑒定；流式細(xì)胞術(shù)研究其抗原呈遞；酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(Enzyme linkedimmunospot assay，ELISPOT)和標(biāo)準(zhǔn)<'51>Cr釋放試驗(yàn)分別檢測瘤苗所誘導(dǎo)的特異性CTL活性；并對Babl/c小鼠荷瘤模型進(jìn)行免疫學(xué)效應(yīng)評價。研究結(jié)果提示：掃描電鏡和免疫印跡證實(shí)“模擬病毒”瘤苗制備成功，并能有效介導(dǎo)“模擬病毒”瘤苗所攜帶基因

10、的表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)檢測證明“模擬病毒”瘤苗能成功呈遞相關(guān)腫瘤表位抗原肽；ELISPOT和標(biāo)準(zhǔn)<'51>Cr釋放試驗(yàn)顯示能在體內(nèi)有效激發(fā)抗原特異性CTL效應(yīng)，可誘導(dǎo)CTL產(chǎn)生IFN-γ等細(xì)胞因子，并對結(jié)腸癌細(xì)胞系CT26有明顯的殺傷毒性；腫瘤治療實(shí)驗(yàn)證實(shí)“模擬病毒”瘤苗能有效抑制腫瘤的生長速度、提高荷瘤動物的生存率。研究結(jié)果充分說明基于survivin的“模擬病毒”瘤苗能有效激發(fā)出特異性CTL應(yīng)答，并在荷瘤動物模型中有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞CT