熱休克效應(yīng)對(duì)細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng).pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容主要是對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熱休克預(yù)處理，用過(guò)氧化氫和加熱來(lái)研究熱休克效應(yīng)對(duì)物理和化學(xué)因子引起的細(xì)胞損傷的保護(hù)效應(yīng)，指標(biāo)主要有細(xì)胞的存活率和DNA雙鏈斷裂率。 研究目的為：(1)證實(shí)熱休克預(yù)處理對(duì)胚胎細(xì)胞是否有保護(hù)效應(yīng)。(2)證實(shí)熱休克預(yù)處理不但可以提高細(xì)胞存活率還可以減少細(xì)胞DNA的雙鏈斷裂。具體內(nèi)容為：(1)研究熱休克預(yù)處理對(duì)H<,2>O<,2>處理后的V79、NIH3T3細(xì)胞存活率的變化，觀察熱休克效應(yīng)是否可以提高胚

2、胎細(xì)胞的存活率。(2)研究熱休克處理對(duì)細(xì)胞DNA雙鏈斷裂的影響。(3)研究熱休克預(yù)處理對(duì)高溫引起的細(xì)胞DNA雙鏈斷裂的影響。 方法：實(shí)驗(yàn)共分為三個(gè)部分：(1)培養(yǎng)NIH3T3和V79細(xì)胞，熱休克預(yù)處理后，采用不同濃度的H<,2>O<,2>處理細(xì)胞，不同恢復(fù)時(shí)間后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。(2)培養(yǎng)NIH3T3細(xì)胞，經(jīng)37℃、39℃、42℃、43℃、45℃不同熱休克預(yù)處理溫度處理后，多聚甲醛固定，用抗γ-H2AX抗體孵育過(guò)夜，

3、再用結(jié)合FITC羊-抗-鼠第二抗體室溫下標(biāo)記，激光共聚焦顯微鏡下觀察DNA雙鏈斷裂所形成的斑點(diǎn)數(shù)量變化。(3)培養(yǎng)V79細(xì)胞，不同熱休克處理溫度和不同恢復(fù)時(shí)間，不同高溫處理后，固定，用抗γ-H2AX抗體孵育過(guò)夜，用結(jié)合FITC羊-抗-鼠第二抗體室溫下標(biāo)記，激光共聚焦顯微鏡下觀察DNA雙鏈斷裂所形成的斑點(diǎn)數(shù)量變化。 結(jié)果：(1)對(duì)于NIH3T3細(xì)胞，最好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是熱休克預(yù)處理組可以比對(duì)照組提高細(xì)胞存活率40％左右，對(duì)于V79細(xì)胞

4、，最好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是熱休克預(yù)處理組可以比對(duì)照組提高細(xì)胞存活率20％左右。不同熱休克預(yù)處理后恢復(fù)時(shí)間(大于2小時(shí))對(duì)細(xì)胞的存活率沒(méi)有明顯影響。(2)細(xì)胞經(jīng)過(guò)熱休克處理后，立即固定，用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞：有多少DNA雙鏈斷裂點(diǎn)就可以在細(xì)胞中觀察到多少亮點(diǎn)，對(duì)照組有斑點(diǎn)細(xì)胞數(shù)小于細(xì)胞總數(shù)的5％。45℃條件下預(yù)處理后，在激光共聚焦顯微鏡下則可以觀察到所有細(xì)胞核中都有因DNA雙鏈斷裂而形成的斑點(diǎn)。39℃處理的細(xì)胞，核內(nèi)雙鏈斷裂的斑點(diǎn)無(wú)明顯增多

5、，有斑點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)有少量增多。42℃處理的細(xì)胞有雙鏈斷裂斑點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞核內(nèi)斑點(diǎn)增加不明顯，但經(jīng)過(guò)43℃處理的細(xì)胞，細(xì)胞核中有雙鏈斷裂的斑點(diǎn)的細(xì)胞和細(xì)胞核中的斑點(diǎn)數(shù)量都有顯著的增多。(3)細(xì)胞采用不同高溫，不同熱休克處理溫度，不同恢復(fù)時(shí)間處理后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)41℃熱休克預(yù)處理1小時(shí)可以顯著減少DNA雙鏈斷裂的量，為最佳熱休克處理?xiàng)l件。不同熱休克預(yù)處理溫度對(duì)細(xì)胞雙鏈斷裂的影響有顯著性差異，但不同恢復(fù)時(shí)間處理的細(xì)胞之間并未檢測(cè)到顯著性差異。