熱休克的細(xì)胞遺傳毒性研究.pdf

1、熱休克能引起許多與DNA半保留復(fù)制相關(guān)的細(xì)胞核功能的變化,包括了新的復(fù)制的起始,DNA在復(fù)制叉處的延長(zhǎng),新的組蛋白進(jìn)入染色質(zhì)過(guò)程中的合成和沉積,新合成DNA形成染色體的識(shí)別.熱休克,尤其當(dāng)其溫度超過(guò)42℃時(shí)能引起細(xì)胞死亡,但是這其中的分子機(jī)制還不十分清楚.盡管有文獻(xiàn)報(bào)道DNA損傷有可能參與了熱休克殺傷細(xì)胞的過(guò)程,也有研究發(fā)現(xiàn)熱休克并不能誘導(dǎo)DNA的損傷.所以進(jìn)一步研究熱休克導(dǎo)致細(xì)胞死亡的機(jī)制中是否有DNA損傷的參與是非常有必要的.

2、 單功能烷化劑甲基硝基亞硝基胍(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine.MNNG)是一種在環(huán)境中廣泛存在的化學(xué)誘變劑和致癌劑.它是一種N-亞硝基化合物,屬于可直接與DNA作用的遺傳毒物,通過(guò)直接靶定DNA而誘發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生遺傳毒性應(yīng)激,并導(dǎo)致染色體異常、姐妹染色單體改變、點(diǎn)突變以及細(xì)胞死亡,是化學(xué)致癌物誘變機(jī)理研究中常用的一種模式化合物.此外,研究者們應(yīng)角彗星實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MNNG能誘導(dǎo)細(xì)胞DNA雙鏈斷裂的形成

3、. 近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),DNA雙鏈斷裂(DNA double strand breaks,DSBs)出現(xiàn)后,組蛋白家族成員H2AX C-端139位絲氨酸殘基(Ser)可被磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3.kinase,PI3K)樣家族成員磷酸化形成yH2AX(garoma-H2AX).γH2AX可以募集其它DNA修復(fù)蛋白到損傷位點(diǎn),形成焦點(diǎn)(10ci)結(jié)構(gòu),共同完成DNA修復(fù)過(guò)程.在電離輻射(ioni

4、zing radiation,IR)后,在損傷位點(diǎn)快速形成γH2AX焦點(diǎn),并且焦點(diǎn)的數(shù)量與IR造成的DSBs的數(shù)量存在一一對(duì)應(yīng)關(guān)系,表明yH2AX焦點(diǎn)的形成可用于檢測(cè)IR誘導(dǎo)的DSBs.另外發(fā)現(xiàn),其它間接導(dǎo)致DSBs的遺傳毒物如順鉑、喜樹(shù)堿也誘導(dǎo)γH2AX焦點(diǎn)的形成.因此,直接或者間接導(dǎo)致的DSBs的產(chǎn)生都能誘導(dǎo)γH2AX焦點(diǎn)的形成.γH2AX焦點(diǎn)與DSBs之間的密切關(guān)系表明γH2AX極有可能成為檢測(cè)細(xì)胞DNA損傷特別是DSBs的一個(gè)新

5、的特異性指標(biāo). 鑒于以上原因,為了進(jìn)一步研究熱休克能否引起細(xì)胞的遺傳毒性,我們用γH2AX作為DNA損傷的指標(biāo),對(duì)熱休克的遺傳毒性進(jìn)行了系統(tǒng)研究. 熱休克可降低細(xì)胞的生存率熱休克(45℃,30 min)處理CHL、HeLa細(xì)胞后,間隔不同時(shí)間,用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率.結(jié)果發(fā)現(xiàn):熱休克45℃,30 min可使CHL、HeLa細(xì)胞的存活率下降.將細(xì)胞放置于37℃繼續(xù)孵育并不能逆轉(zhuǎn)熱休克后生存率下降的趨勢(shì),在熱休克后0.5

6、、2、8和24 h,CHL、Hel_丑細(xì)胞的存活率與未經(jīng)熱休克處理的對(duì)照組相比也是降低的,并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)與對(duì)照組相比細(xì)胞的相對(duì)生存率降低. 免疫熒光實(shí)驗(yàn)證明熱休克不能在HeLa或CHL細(xì)胞中誘導(dǎo)γH2AX焦點(diǎn)的形成HeLa或CHL細(xì)胞在45℃熱休克30 min后繼續(xù)在37℃孵育0、0.5、2和8 h后,與空白對(duì)照組相比CHL細(xì)胞中γH2AX焦點(diǎn)的數(shù)量無(wú)明顯變化,仍然是多數(shù)細(xì)胞無(wú)γH2AX焦點(diǎn)的存在,少部分細(xì)胞中含有1-10或

7、更多的焦點(diǎn).這表明熱休克不能誘導(dǎo)γH2AX焦點(diǎn)的形成. 熱休克不能在p53缺失細(xì)胞中誘導(dǎo)γH2AX焦點(diǎn)形成p53在維持細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性中發(fā)揮著重要作用,因此我們進(jìn)一步探討p53的缺失可否影~H2AX焦點(diǎn)的形成.為此我們采用了U2OSE6tet24細(xì)胞.此種細(xì)胞在培養(yǎng)基中有四環(huán)素存在的情況下,p53有正常的表達(dá),在缺乏四環(huán)素的時(shí)候則無(wú)p53的表達(dá).我們發(fā)現(xiàn),在p53缺失的情況下熱休克處理后γH2AX焦點(diǎn)的數(shù)目并沒(méi)有增多,表明熱休

8、克不能在p53缺失的細(xì)胞中誘導(dǎo)YH2AX焦點(diǎn)的形成. 熱休克不能在FENl缺失細(xì)胞中誘導(dǎo)yH2AX焦點(diǎn)的形成FENl在DNA復(fù)制和修復(fù)中起了非常重要的作用,我們發(fā)現(xiàn)FEN1的缺失可以導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定,并且能夠增強(qiáng)MNNG的細(xì)胞毒性反應(yīng),因此我們選用此種細(xì)胞來(lái)進(jìn)一步檢測(cè)FEN1的缺失是否會(huì)影響由熱休克所引起的細(xì)胞的YH2AX焦點(diǎn)形成.結(jié)果發(fā)現(xiàn),在FEN1缺失細(xì)胞中,熱休克處理后yH2AX的數(shù)目較之空白對(duì)照組沒(méi)有增多.表明熱休克不能

9、誘導(dǎo)FENl缺失細(xì)胞產(chǎn)γH2AX焦點(diǎn). 熱休克預(yù)處理可抑制MNNG誘導(dǎo)的γH2AX焦點(diǎn)的形成為了進(jìn)一步研究熱休克與其他藥物協(xié)同作用后對(duì)細(xì)胞γH2AX焦點(diǎn)形成的影響,我們觀察了熱休克預(yù)處理后MNNG誘導(dǎo)細(xì)胞γH2AX焦點(diǎn)的情況.1μg/mlMNNG在FL、CHL細(xì)胞中作用2 h能強(qiáng)烈誘導(dǎo)γH2AX焦點(diǎn)的形成.然而,當(dāng)FL、CHL細(xì)胞在45℃熱休克30 min后再進(jìn)行1μg/ml MNNG處理2 h,用免疫熒光和流式細(xì)胞儀檢測(cè)的到的

10、結(jié)果都顯示YH2AX焦點(diǎn)數(shù)目與熒光強(qiáng)度都較之單純MNNG處理組降低. 熱休克后處理不影響MNNG誘導(dǎo)的γHZAX焦點(diǎn)的形成因?yàn)闊嵝菘祟A(yù)處理可影響MNNG誘導(dǎo)的γH2AX焦點(diǎn)的形成,所以我們進(jìn)一步探討對(duì)于已經(jīng)被MNNG誘導(dǎo)產(chǎn)生的γH2AX焦點(diǎn),熱休克是否也能夠使其數(shù)目減少或者熒光度降低.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在MNNG誘導(dǎo)產(chǎn)生γH2AX焦點(diǎn)后再進(jìn)行熱休克(45℃,30 min),通過(guò)免疫熒光和流式細(xì)胞儀對(duì)γH2AX焦點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè),其數(shù)目和熒光

11、強(qiáng)度并沒(méi)有減少或者降低. 結(jié)論:第一,熱休克后細(xì)胞的生存率降低,說(shuō)明熱休克具有細(xì)胞毒性.第二,熱休克后在CHL、HeLa細(xì)胞中用免疫熒光及流式細(xì)胞儀都檢測(cè)不到Y(jié)H2Ax的增多,并且在p53缺失以及FEN1缺失的細(xì)胞中也是如此,說(shuō)明熱休克不能誘導(dǎo)CHL、HeLa產(chǎn)生γH2AX,p53和FEN1也并不參與熱休克影響細(xì)胞產(chǎn)生γH2AX的過(guò)程.第三,熱休克預(yù)處理減少了MNNG誘導(dǎo)的γH2AX焦點(diǎn)的形成,說(shuō)明熱休克可影響MNNG誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)