馬立克氏病病毒MEQ蛋白抗體制備及疫苗株與強毒株MEQ基因?qū)?xì)胞因子表達(dá)影響.pdf

1、馬立克氏病(Marek's disease，MD)是由禽馬立克氏病病毒引起的一種最常見的一種雞淋巴組織增生性傳染病，主要以外周神經(jīng)和包括虹膜、皮膚在內(nèi)的各種器官和組織的單核性細(xì)胞浸潤為特征。本病是由一種皰疹病毒引起，傳染性強，在病原學(xué)上與雞的其他淋巴腫瘤病不同。MD存在于世界上所有養(yǎng)禽國家和地區(qū)，其危害隨著養(yǎng)雞業(yè)的集約化而增大，受害雞群的損失從不到1％到超過30％不等，個別雞群可達(dá)50％以上。感染除了引起雞群的直接損害外，還造成嚴(yán)重的免

2、疫抑制，生產(chǎn)力下降，混合感染，繼發(fā)感染等，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。在眾多馬立克氏病病毒的已鑒定的基因型中，目前有3個基因即132-BPR、PP38、MEQ基因猜測可能與致瘤有關(guān)。這其中，MEQ與132-BPR兩個基因是MDV-1所特有，已證實毒株的體外致弱程度與132BPR的拷貝數(shù)目有相關(guān)關(guān)系，PP38則被證實為機(jī)體的免疫應(yīng)答可被其抑制。MEQ基因由于有與致瘤基因jun/fos家族類似的分子結(jié)構(gòu)，因此我們認(rèn)為NEQ基因

3、可能在MDV致病、致瘤中發(fā)揮重要的作用。而HVT（火雞皰疹病毒）也具有MEQ基因，而其MEQ基因無論是致病性還是致瘤性都遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于強毒株MEQ基因?；谶@一發(fā)現(xiàn)，本研究表達(dá)了馬立克氏病MEQ部分基因蛋白，并制備了多克隆抗體，為進(jìn)一步研究馬立克氏病病毒的基因功能提供技術(shù)支持;同時構(gòu)建了pcDNA3.1-CVI988-MEQ、pcDNA3.1-RB1B-MEQ真核表達(dá)載體，進(jìn)而通過熒光定量PCR的方法研究兩種MEQ基因?qū)λ拗骷?xì)胞因子表達(dá)的影響

4、。
　　1.MEQ基因的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備
　　設(shè)計馬立克氏病毒MEQ基因前450個堿基的基因片段引物，應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)擴(kuò)增目的片段，將目的基因與pGEM-T載體進(jìn)行連接，構(gòu)建含MEQ基因前450堿基的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pGEM-T-MEQ，將鑒定正確的pGEM-T-MEQ基因的重組質(zhì)粒用目的酶酶切，再與pGEX-6p-1載體連接，構(gòu)建并鑒定重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-MEQ。用傳統(tǒng)的方法大量誘導(dǎo)表達(dá)pGEX-

5、6p-1-MEQ重組菌。誘導(dǎo)的蛋白經(jīng)GST蛋白純化柱純化后，按計劃免疫6-8周齡BALB/c小鼠，分離小鼠血清得到抗馬立克氏病毒MEQ蛋白的多克隆抗體。同時利用間接免疫熒光和Western blot對獲得的多抗血清進(jìn)行鑒定。
　　馬立克氏病毒MEQ多克隆抗體的制備為進(jìn)一步研究NEQ基因的生物學(xué)功能提供良好的生物材料。
　　2.疫苗株與強毒株MEQ基因?qū)?xì)胞因子表達(dá)影響
　　研究馬立克氏病毒不同毒株MEQ蛋白對與細(xì)胞d然

6、免疫相關(guān)的細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響，本研究將CVI988-MEQ、RB1B-MEQ基因克隆到pcDNA3.1(+)中，構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1-CVI988-MEQ、pcDNA3.1-RB1B-MEQ，并將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞進(jìn)行暫態(tài)表達(dá)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后分別加入同一濃度的Poly(I∶C)刺激，在細(xì)胞刺激后6，12，24小時收集細(xì)胞提取RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用Real-time PCR檢測CEF細(xì)胞中炎性因子和抗病毒因