馬立克氏病病毒致瘤蛋白Meq及雞ATM和Chk2單克隆抗體制備.pdf

1、馬立克氏病(Marek's Disease，MD)是由馬立克氏病病毒(Marek's Disease Virus，MDV)引起的雞的一種惡性淋巴組織增生性腫瘤疾病。自20世紀(jì)70年代在我國(guó)首次報(bào)道以來，給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，疫苗的使用雖然基本控制了MD的疫情，但由于MDV突變株毒力逐漸增強(qiáng)，可以突破疫苗的保護(hù)作用，導(dǎo)致雞群中免疫失敗的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。因此，了解MDV的致瘤機(jī)理，研制更有效的疫苗或藥物制劑是當(dāng)前急需解決的問

2、題。
　　近年來，研究發(fā)現(xiàn):DNA損傷應(yīng)答(DNA damage response，DDR)信號(hào)通路幾乎是所有人類致瘤病毒的共同作用靶點(diǎn);MDV的關(guān)鍵致瘤蛋白Meq能夠與p53結(jié)合并抑制p53對(duì)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄作用;由此可見，MDV感染伴有宿主細(xì)胞DDR通路的激活。因此，研究MDV調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞DDR信號(hào)通路的分子機(jī)理，對(duì)于理解MDV的致病機(jī)理具有重要意義。但是，關(guān)于雞源DDR信號(hào)通路的研究較少，目前尚不存在商品化的抗體用于檢測(cè)MD

3、V的關(guān)鍵致瘤蛋白Meq及雞DDR信號(hào)通路上的關(guān)鍵蛋白ATM和Chk2。因此，本研究主要致力于制備能特異性識(shí)別Meq、雞ATM和Chk2單克隆抗體，為進(jìn)一步研究MDV調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞DDR信號(hào)通路的分子機(jī)理提供重要的生物材料。主要包括以下三部分內(nèi)容:
　　1.MDV致瘤蛋白Meq單克隆抗體制備
　　選取馬立克氏病毒(MDV) RB1B株的Meq蛋白N端1-169位和C端272-340位氨基酸，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pCold-TF-Me

4、q169和pGEX-4T-1-MeqC，在BL21(DE3)細(xì)菌中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行分析，并免疫Balb/c小鼠，利用IFA及WB檢測(cè)多抗血清;血清檢測(cè)陽性后，取小鼠脾臟與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合，利用IFA和有限稀釋法篩選陽性單克隆雜交瘤細(xì)胞株，結(jié)果:Meq169單抗篩選出了4株陽性雜交瘤細(xì)胞株，即1C11、3E4、3G10和5H11。通過IFA將獲得的單抗用于檢測(cè)強(qiáng)毒

5、株Md5或弱毒株CVI988感染的CEF細(xì)胞，結(jié)果顯示，Meq169單抗與MDV感染形成的細(xì)胞病變呈陽性反應(yīng);MeqC單抗篩選出了10株具有IFA反應(yīng)性的陽性雜交瘤細(xì)胞株，即1B5、1E10、2C11、2C12、2E10、2G9、3B7、3E8、3F11和4B8;其中，2C12還具有WB反應(yīng)性。
　　2.雞ATM單克隆抗體制備
　　通過對(duì)雞ATM氨基酸序列的抗原性分析，選取C端2993-3050位氨基酸，常規(guī)PCR擴(kuò)增相應(yīng)的

6、核苷酸序列，克隆入原核表達(dá)載體pGEX-4T-1，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-ATMC，轉(zhuǎn)化入Rosetta感受態(tài)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，通過SDS-PAGE對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分離鑒定，證實(shí)了重組ATMC蛋白可得到有效表達(dá);表達(dá)產(chǎn)物免疫Balb/c小鼠，將轉(zhuǎn)染重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-ATMC的293T作為檢測(cè)源，利用IFA檢測(cè)多抗血清，結(jié)果顯示多抗血清具有良好的熒光效價(jià);取陽性小鼠脾臟與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合，利用IFA篩選

7、陽性雜交瘤細(xì)胞株，最后篩選出了12株具有IFA反應(yīng)性的陽性雜交瘤細(xì)胞株，即1F3、2B10、2H8、3G3、3G12、4A10、4B4、4B11、4C7、4D3、4D5及4E9;其中，2B10還具有WB反應(yīng)性。
　　3.雞Chk2單克隆抗體制備
　　通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增雞chk2基因，將其克隆到原核表達(dá)載體pGEX-4T-3中，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-3-Chk2，將重組原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL