雞馬立克氏病病毒超強毒株RB1B pp38基因的真核表達及其特異性單克隆抗體的研制.pdf

1、根據(jù)Genbank發(fā)表資料，設計了一對引物，應用PCR方法擴增出雞馬立克氏病病毒超強毒株RB1B pp38基因，將PCR產(chǎn)物克隆到pGEM-T easy載體，經(jīng)限制性酶切分析和測序證實擴增到的pp38基因序列完全正確。用BamH I和Pst I酶將該基因片段從pGEM-T easy載體切下，回收目的DNA片段并與桿狀病毒轉座載體pFastBac 1連接，篩選出重組轉座載體pFastBac 1-pp38，轉座含有桿狀病毒穿梭質(zhì)粒的大腸桿菌

2、DH10Bac感受態(tài)細胞后，獲得重組穿梭質(zhì)粒rBacmid-pp38；將重組質(zhì)粒DNA轉染Sf9昆蟲細胞，獲得了含有雞馬立克氏病病毒超強毒株RB1B pp38基因的重組桿狀病毒rBaemid-pp38(r pp38)。重組病毒感染Sf9細胞后，用IFA方法對細胞表達產(chǎn)物進行檢測，結果表明：構建的重組桿狀病毒能夠在昆蟲細胞中表達雞馬立克氏病病毒超強毒株RB1B pp38蛋白。 將表達雞馬立克氏病病毒超強毒株RB1B pp38蛋白的

3、昆蟲細胞免疫BALB/C小鼠，取其脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0融合。用丙酮乙醇固定液固定的感染了雞馬立克氏病病毒超強毒株RB1B的雞成纖維細胞CEF，通過間接免疫熒光試驗(IFA)檢測雜交瘤細胞培養(yǎng)上清，結果篩選出1株分泌抗MDV-PP38蛋白抗體的陽性雜交瘤細胞株，命名為pp38-2F6，經(jīng)2次亞克隆后，100％雜交瘤細胞保持了分泌抗體的能力。間接免疫熒光試驗證明，這一株單克隆抗體能與MDV-RB1B以及MDV-CVI988感染的