AGEs引起過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激致腎小管上皮細胞早衰促進糖尿病腎病腎間質(zhì)纖維化—ATF4-p16-p21的作用.pdf

1、細胞衰老的本質(zhì)是細胞周期停滯導(dǎo)致細胞增殖和再生能力喪失，因此而造成組織結(jié)構(gòu)和器官功能的適應(yīng)性變化。增齡通常導(dǎo)致細胞發(fā)生復(fù)制性衰老，依賴端粒縮短以及端粒酶的調(diào)控，是一個程序化的生物學(xué)過程（Programmedbiologicalprocess），其衰老速度和程度呈現(xiàn)出自主性和有序性，使衰老器官呈現(xiàn)出適應(yīng)性變化而不是疾病表型。不過，越來越多的證據(jù)顯示，各種病理性應(yīng)激因素可以直接損傷DNA、激活原癌基因（Oncogeneactivation）

2、或端?？s短進而激活細胞周期負調(diào)控因子p16/Rb和/或ARF/p53，使細胞生長不可逆地停滯于G0/G1期，被稱為應(yīng)激誘導(dǎo)的早衰或細胞加速衰老。衰老細胞的特征性表現(xiàn)為細胞肥大、胞漿SA-β-gal活性增強、端?？s短以及細胞周期負調(diào)控因子p16和p21陽性等。目前認為，無論程序化的自然細胞衰老還是疾病相關(guān)的細胞早衰，最終殊途同歸，成為組織器官纖維化的重要病理生理基礎(chǔ)；反之，細胞衰老機制障礙則導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移。因此，細胞早衰與疾病導(dǎo)致器官

3、纖維化的關(guān)系近年來受到高度關(guān)注。
　　糖尿病腎病(DiabeticNephropathy，DN)是糖尿病最為嚴重的并發(fā)癥，極易進展為慢性腎衰竭。已證實，腎間質(zhì)纖維化（Tubulointerstitialfibrosis，TIF）在糖尿病腎病走向慢性腎衰竭的進程中發(fā)揮主導(dǎo)作用，表現(xiàn)為腎小管上皮細胞丟失、慢性炎癥和細胞外基質(zhì)堆積，但發(fā)生機制尚不十分清楚。近年來研究發(fā)現(xiàn)，心肌細胞、內(nèi)皮細胞、神經(jīng)細胞以及間充質(zhì)細胞等細胞早衰與心腦血管疾病

4、的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。來自于非老年相關(guān)的慢性腎臟疾?。–KD）的研究表明，腎實質(zhì)細胞早衰通常伴有腎組織慢性損傷的組織學(xué)變化，例如腎小球硬化、腎小管萎縮和炎癥反應(yīng)等，提示細胞早衰是一種腎組織損害的病理表現(xiàn)形式，而非單純增齡所致的生理性變化。新近研究發(fā)現(xiàn)，高糖可以引起腎實質(zhì)細胞早衰，后者與腎組織結(jié)構(gòu)和腎功能損害相關(guān)，提示細胞早衰可能不僅僅是DN的結(jié)果或伴隨現(xiàn)象，還可能是促進DN走向慢性腎衰竭的主動參與者。不過目前并不完全清楚糖尿病腎病時腎小管

5、上皮細胞早衰的原因和機制是什么？細胞早衰為什么會導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化？
　　終末期糖基化產(chǎn)物(AdvancedGlycationEndProducts，AGEs)是導(dǎo)致糖尿病腎病的主要原因之一。最近研究發(fā)現(xiàn)AGEs可引起足細胞和系膜細胞的細胞周期停滯和腎小球硬化。我們感興趣的是AGEs是否也可以通過引起腎小管上皮細胞早衰在糖尿病腎病進展中發(fā)揮重要病作用。研究證實，AGEs、淀粉樣蛋白β等有害物質(zhì)可以通過影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)穩(wěn)態(tài)導(dǎo)致未折疊蛋白蓄

6、積或蛋白質(zhì)異常修飾引起細胞過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(EndoplasmicReticulumStress，ERS)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是調(diào)控細胞存活、增殖和分化的關(guān)鍵機制，越來越多的證據(jù)顯示，過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激不僅是糖尿病、心腦血管疾病等老年病以及慢性腎臟疾病進展的重要機制，而且還能影響甚至驅(qū)動衰老進程本身。過度ERS可以加速小鼠出現(xiàn)衰老相關(guān)的腎臟結(jié)構(gòu)和功能變化。ATF4是一種堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子（Basicleucine-zipper(bZip)tran

7、scriptionfactor），通過與下游靶基因啟動子結(jié)合調(diào)控諸多生物學(xué)效應(yīng)，包括細胞增殖、分化、細胞凋亡、自噬以及炎癥反應(yīng)等，被認為哺乳類進化保守的應(yīng)激反應(yīng)途徑中的主控調(diào)節(jié)因子（Masterregulator）。在糖尿病、心血管疾病以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。最近的研究顯示，ATF4基因沉默可以顯著抑制人黑色素細胞(MC)衰老，過表達ATF4可抑制小鼠乳腺上皮細胞和神經(jīng)細胞的細胞周期蛋白導(dǎo)致細胞生長停滯，提示ATF4可能對細胞

8、衰老進程具有調(diào)控作用。
　　據(jù)此，我們提出“AGEs引起過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激致腎小管上皮細胞早衰促進糖尿病腎間質(zhì)纖維化—ATF4-p16/p21的作用”假說。
　　一、實驗方法
　　1.臨床病例
　　選取2009年2月至2010年12月重慶大坪醫(yī)院腎內(nèi)科收治的老年患者（即60歲以上）經(jīng)病理確診為2型糖尿病腎病病例20例，分為早期糖尿病腎病組（Pro:500—2000mg/day;Scr≤120umol/l，8例）和進展

9、期糖尿病腎病組（Pro:>2000mg/day;Scr>120umol/l，12例）。對照組8例，其腎組織標本均取自60歲以上的腎腫瘤患者切除腎臟的遠離腫瘤部分經(jīng)病理檢查為正常腎組織（尿蛋白<500mg/day;Scr:<120umol/l）。所有病例使用胰島素控制血糖，CCB類降壓藥和利尿劑控制血壓，在行腎活檢3月內(nèi)未服用任何中藥。
　　2.原代腎小管上皮細胞培養(yǎng)及鑒定
　　無菌條件下獲取2-3周齡C57/BL6雄性小鼠腎

10、皮質(zhì)，膠原酶消化腎組織，篩濾、分離、培養(yǎng)原代小鼠腎小管上皮細胞，細胞免疫熒光檢測腎小管上皮細胞特異性表面標記物CK18的表達。將培養(yǎng)至第2代的腎小管上皮細胞用于以下實驗，培養(yǎng)至第6代腎小管上皮細胞作為自然衰老細胞。
　　3.細胞分組
　　3.1 AGE-BSA作用腎小管上皮細胞的量效和時效分組
　　量效分組：分別以0、0.15、0.75、1.5、7.5uM的AGE-BSA及相同濃度的BSA刺激腎小管上皮細胞48小時；時

11、效分組：以7.5uM的AGE-BSA及同濃度的BSA分別刺激細胞0、12、24、36、48小時。
　　3.2 ERS誘導(dǎo)劑作用腎小管上皮細胞的時效分組
　　細胞分組為：正常對照組、DMSO組、TM組、TG組，其中TM和TG濃度分別為0.5ug/ml、0.1uM，分別培養(yǎng)48和72hour。
　　3.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑作用腎小管上皮細胞分組
　　分為正常對照組、AGE-BSA組、AGE-BSA組+4-PBA組，其

12、中AGE-BSA和4-PBA濃度分別為7.5uM、5mM，培養(yǎng)48hour。
　　3.4 ATF4siRNA轉(zhuǎn)染腎小管上皮細胞分組
　　分別以脂質(zhì)體LipofectamineTM2000加對照siRNA（0.05μM）、ATF4siRNA（0.05μM）轉(zhuǎn)染腎小管上皮細胞24h后，細胞分組為：對照組、對照組+ConsiRNA組、對照組+ATF4siRNA組、BSA組、BSA組+ConsiRNA組、BSA組+ATF4siRNA

13、組、AGE組、AGE組+ConsiRNA組、AGE組+ATF4siRNA組，其中BSA和AGE濃度均為7.5uM，培養(yǎng)48hour。
　　3.5 ATF4-GFP轉(zhuǎn)染腎小管上皮細胞分組
　　細胞分組為：對照組、GFP-空載體組，ATF4-GFP組，其中GFP-空載體、ATF4-GFP腺病毒滴度為5×108PFUml，轉(zhuǎn)染48hour。
　　4.檢測指標與方法
　　4.1 ELISA檢測糖尿病腎病患者血清及尿AGE

14、s水平
　　采用ELISA試劑盒檢測DN患者血清及尿AGEs水平。
　　4.2 免疫組化檢測腎小管上皮細胞GRP78、ATF4表達
　　石蠟包埋組織切片2～4um厚，脫蠟、水化；高壓法修復(fù)抗原；3％H2O2室溫孵育15min；PBS沖洗；山羊血清封閉15min；一抗GRP78(1：400)、ATF4(1：50)、4℃孵育過夜；PBS沖洗；滴加辣根過氧化物酶標記抗小鼠或抗兔IgG，室溫孵育30min；PBS沖洗；DAB鏡

15、下顯色；蘇木素復(fù)染；脫水透明、封片。
　　4.3 免疫熒光檢測腎小管上皮細胞GRP78、ATF4、p16、p21、FN、ColⅢ和TGF-β表達與分布
　　冰凍切片冷丙酮固定20min或細胞常規(guī)爬片后多聚甲醛固定20min，PBS沖洗；山羊血清封閉15min；一抗4℃過夜；PBS沖洗；分別滴加二抗FITC標記的IgG(1：50)和Cy3標記的IgG(1：50)，37℃孵育1hou；PBS沖洗；DAPI染核；甘油封片，激光共聚

16、焦下觀察。
　　4.4 常規(guī)生化方法檢測腎小管上皮細胞SA-β-gal表達
　　按照SA-β-gal染色試劑盒操作步驟，予PH=6.0的酸性液清洗后滴加SA-β-gal染色工作液，37℃孵育12hour，室溫晾干、封片。
　　4.5 結(jié)果判讀方法：
　?、倌I小管上皮細胞SA-β-gal陽性染色率：光學(xué)顯微鏡下見腎小管上皮細胞呈藍色者為SA-β-gal陽性，參考Verzola等人[7]的檢測方法，每張切片至少隨機計

17、算10個高倍視野，以SA-β-gal陽性染色的腎小管占總共腎小管的比例表示SA-β-gal陽性百分比；
　?、谀I小管上皮細胞p16、p21雙陽性細胞百分比：激光共聚焦觀察計數(shù)腎小管上皮細胞胞核p16、p21呈雙陽性表達的腎小管上皮細胞占腎小管上皮細胞總數(shù)的百分比例；
　　③腎小管上皮細胞GRP78、ATF4表達評分：計數(shù)GRP78呈陽性表達的腎小管上皮細胞或胞核ATF4呈陽性表達的腎小管上皮細胞占腎小管上皮細胞總數(shù)的百分比例

18、，結(jié)果分為4級：0分：無陽性染色或單個陽性染色的細胞；1分：弱表達，陽性率10％～35％；2分：中度表達，陽性率35％～70％；3分：強表達，陽性率>70％。每張切片在低倍視野下（×100倍）隨機選擇10個視野，取其平均值。注：上述結(jié)果的判讀均采用盲法進行，由2名與本研究無關(guān)人員實施。
　　4.6 DAPI法檢測腎小管上皮細胞衰老相關(guān)異染色質(zhì)凝聚（SAHF）改變
　　細胞爬片；4％多聚甲醛固定30min；PBS沖洗；DAPI

19、染核；甘油封片，激光共聚焦下觀察。
　　4.7 Brdu標記法檢測腎小管上皮細胞增殖
　　Brdu標記液37℃避免孵育90min；PBS沖洗；冷丙酮固定20min；PBS沖洗；山羊血清封閉15min；滴加一抗Brdu，4℃過夜；PBS沖洗；滴加FITC標記的IgG，37℃孵育1hour；PBS沖洗；DAPI染核；甘油封片，激光共聚焦下觀察。
　　4.8 流式細胞技術(shù)檢測腎小管上皮細胞周期比值
　　采用細胞流式分析

20、試劑盒和細胞流式儀檢測細胞周期。流式細胞技術(shù)分選AGE組和自然衰老組G0G1期細胞，提取細胞總蛋白，采用westernblot檢測TGF-β、ColⅢ蛋白的表達。
　　4.9 RT-PCR法檢測腎小管上皮細胞ATF4、p16和p21mRNA表達水平
　　TRIZOL法提取細胞總RNA,在20μL反應(yīng)體系中進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),以cDNA為模板,進行核酸定量。以β-actin作為內(nèi)參對照，引物序列如下：ATF4上游:5'GCCCCC

21、TTTACATTCTTGCAGC3'，下游5'GAGGGGCTATGCTGGGGAGA3'p16上游5'GCCAATCCCAAGAGCAGAGC3'，下游5'CCGCCTTCGCTCAGTTTCTC3'，p21上游5'GCCTTGTCGCTGTCTTGCACT3'，下游5'GAGAGGGCAGGCAGCGTATATA3'；β-actin上游5'CAACTCCATCATGAAGTGTAAC3'，下游5'CCACACGGAGTACTTGCG

22、CTC3'，采用20μL反應(yīng)體系在ABI7500實時熒光定量基因擴增儀進行PCR擴增。對PCR反應(yīng)過程中每一循環(huán)熒光信號進行實時監(jiān)測，獲得Ct值，對2-△△Ct進行統(tǒng)計分析。
　　4.10 Westernblot法檢測腎小管上皮細胞GRP78、ATF4、p16、p21、TGF-β、ColⅢ蛋白的表達
　　提取細胞總蛋白；考馬斯亮藍法檢測蛋白濃度；蛋白高溫變性；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離；轉(zhuǎn)膜；5％脫脂牛奶封閉2h，加入一

23、抗GRP78(1:200)、ATF4 (1:200)、p16 (1:200)、p21(1:200)、TGF-β(1:1000)、ColⅢ (1:1000)，4℃過夜；TBST緩沖液沖洗；加入二抗辣根過氧化物酶標記IgG(1:10000)，室溫孵育1h；TBST緩沖液沖洗；暗室中發(fā)光，X光膠片曝光、顯影、定影。
　　4.11 免疫共沉淀檢測腎小管上皮細胞ATF4蛋白與p16、p21蛋白之間相互作用分別提取對照組、AGEs組、AGEs

24、+ATF4siRNA組、ATF4-GFP組腎小管上皮細胞總蛋白，蛋白質(zhì)分3份，其中一份做Input，剩下的2份分別用抗ATF4單克隆抗體和兔免疫血清(對照IgG)沉淀相應(yīng)的抗原，然后用protein A-agarose把抗原抗體復(fù)合物吸附于agarose珠子上，離心清洗其他蛋白質(zhì)，再用上樣緩沖液和高溫變性方法使agarose珠子與蛋白質(zhì)復(fù)合物分離，經(jīng)SDS-PAGE 把抗原和抗體分離，Western blotting分析ATF4、p16

25、和p21蛋白表達。
　　4.12 統(tǒng)計學(xué)方法：計量資料均以均數(shù)±標準差(x±s)表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(One-Way-ANOVA)，相關(guān)性檢驗采用直線相關(guān)分析。結(jié)果以P＜0.05為相差顯著。
　　二、結(jié)果
　　1. AGEs誘導(dǎo)腎小管上皮細胞早衰的作用和意義
　　1.1 AGEs誘導(dǎo)腎小管上皮細胞早衰的作用體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者eGFR顯著降低，24h尿蛋白水平、血清AGEs水平

26、及尿AGEs/Cr顯著高于同齡對照組水平(P＜0.05)，血AGEs水平與eGFR的變化呈顯著負相關(guān)關(guān)系（r=-0.722，P＜0.05）。糖尿病患者腎組織胞漿 SA-β-Gal 陽性的腎小管上皮細胞顯著增多，胞核p16、p21雙陽性的腎小管上皮細胞比例增加，且與尿AGEs/Cr呈顯著正相關(guān)關(guān)系 (r=0.735，P＜0.05；r=0.579，P＜0.05)。結(jié)果提示糖尿病腎病時腎小管上皮細胞早衰與腎臟排泄AGEs增加有關(guān)。體外實驗發(fā)現(xiàn)

27、，隨AGE-BSA作用濃度和時間遞增，腎小管上皮細胞SA-β-gal、SAHF 陽性率以及G0/G1期細胞比例均顯著增高(P＜0.05)，Brdu核陽性細胞比例顯著降低(P＜0.05)。Western bolt檢測顯示AGEs 上調(diào)腎小管上皮細胞p16和p21蛋白表達。結(jié)果表明AGEs可導(dǎo)致腎小管上皮細胞早衰。
　　1.2 腎小管上皮細胞早衰與糖尿病腎病腎間質(zhì)病變的關(guān)系免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，DN患者腎間質(zhì)p16、p21陽性腎小管上皮細

28、胞增多與ColⅢ、FN表達增加的部位一致；AGEs孵育后，SAHF陽性的腎小管上皮細胞體積增大且胞漿中TGF-β表達增加，這與體外培養(yǎng)的第6代自然衰老腎小管上皮細胞的變化一致。Western bolt檢測顯示，以流式細胞儀分選出AGEs孵育后的G0/G1期腎小管上皮細胞TGF-β和ColⅢ表達增加。結(jié)果提示AGEs誘導(dǎo)的早衰腎小管上皮細胞產(chǎn)生細胞基質(zhì)增加，參與糖尿病腎病腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展。
　　2. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在AGEs誘導(dǎo)腎

29、小管上皮細胞早衰中的作用
　　免疫組化檢測顯示，DN患者腎小管上皮細胞胞漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶分子GRP78表達顯著高于正常對照組(P＜0.05)。免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)GRP78陽性的腎小管上皮細胞，其胞核p16、p21也呈陽性，而對照組盡管GRP78有基礎(chǔ)量表達，但胞核p16、p21呈陰性。結(jié)果提示糖尿病腎病腎小管上皮細胞過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能與細胞早衰有關(guān)。
　　體外研究，Western blot檢測結(jié)果顯示，AGEs上調(diào)腎小管上皮細胞G

30、RP78表達，與AGEs具有時效和量效依賴關(guān)系。免疫熒光顯示，AGEs與腎小管上皮細胞孵育后，其胞漿GRP78和胞核SAHF雙陽性以及胞漿GRP78和胞核p16雙陽性的細胞較對照組顯著增多。結(jié)果提示AGEs引起過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能與細胞早衰有密切關(guān)系。將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA預(yù)處理的腎小管上皮細胞與AGEs進行孵育，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細胞GRP78蛋白表達顯著降低（降低52.3％）；SA-β-gal、SAHF 陽性細胞以及G0/G1期

31、細胞的比例顯著降低(P＜0.05)，Brdu核陽性細胞比例顯著增高(P＜0.05)。結(jié)果表明，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以減輕 AGEs 誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞早衰。
　　為進一步證實內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與細胞早衰的關(guān)系，分別將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑TM和TG與第二代腎小管上皮細胞進行孵育。結(jié)果顯示，TM和TG能顯著上調(diào)腎小管上皮細胞p16、p21蛋白表達(P＜0.05)，且SA-β-gal、SAHF陽性細胞和G0/G1期細胞比例均顯著增高(P＜0.05)，

32、Brdu核陽性細胞顯著降低(P＜0.05)。激光共聚焦檢測顯示，TM和TG與腎小管上皮細胞孵育后，其胞漿GRP78和胞核SAHF雙陽性以及胞漿GRP78和胞核p16雙陽性的細胞較對照組顯著增多。提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑可通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起腎小管上皮細胞早衰。
　　3. AGEs激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)源性轉(zhuǎn)錄因子ATF4與腎小管上皮細胞早衰及間質(zhì)纖維化的關(guān)系
　　免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，對照腎組織中ATF4 僅在腎小管上皮細胞胞漿有少量表達，D

33、N患者ATF4發(fā)生核轉(zhuǎn)位，且ATF4陽性細胞顯著增多。激光共聚焦檢測顯示，DN患者腎小管上皮細胞胞核ATF4與p16 雙陽性以及ATF4與p21雙陽性的細胞增多，而對照組未檢測到腎小管上皮細胞胞核ATF4、p16和p21陽性表達。體外研究顯示，AGEs顯著上調(diào)腎小管上皮細胞ATF4表達，兩者具有濃度和時間依賴關(guān)系(P＜0.05)。激光共聚焦檢測顯示，AGEs組體積增大的ATF4陽性腎小管上皮細胞增多，而對照組腎小管上皮細胞形態(tài)正常，胞漿

34、僅有少量ATF4陽性信號；此外，AGEs組腎小管上皮細胞胞核ATF4與p16雙陽性以及ATF4與p21雙陽性的細胞較對照組顯著增多，提示AGEs引起的細胞早衰可能與ATF4被激活有關(guān)。
　　我們進一步采用ATF4基因沉默和ATF4過表達技術(shù)，驗證ATF4介導(dǎo)腎小管上皮細胞早衰的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ATF4siRNA可顯著抑制腎小管上皮細胞ATF4mRNA和蛋白的表達，抑制效率分別為79.32％、74.08％(P＜0.05)。ATF4基

35、因沉默可以顯著減少AGEs組SA-β-gal、SAHF陽性細胞比例以及G0/G1期細胞(P＜0.05)，Brdu陽性細胞比例顯著增高(P＜0.05)，p16和p21表達減少，ColIII 表達減少。以攜帶ATF4-GFP質(zhì)粒的腺病毒轉(zhuǎn)染腎小管上皮細胞（轉(zhuǎn)染效率為96.78％）后，其ATF4蛋白表達較對照組增加9.45倍。進一步觀察ATF4高表達對腎小管上皮細胞早衰表型的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ATF4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組SA-β-gal、SAHF陽性細胞

36、比例以及G0/G1期細胞與對照組比較顯著增多(P＜0.05)，Brdu陽性細胞比例顯著降低(P＜0.05)；western bolt檢測顯示，p16和p21表達增加，ColIII 表達也顯著上調(diào)。激光共聚焦交顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，ATF4轉(zhuǎn)染組ATF4與p16雙陽性以及ATF4與p21雙陽性的細胞顯著增多，而對照組未見ATF4、p16和p21陽性信號；此外，ATF4轉(zhuǎn)染組TGF-β表達增加，而對照組未見TGF-β表達。結(jié)果表明AGEs可激活

37、ATF4介導(dǎo)腎小管上皮細胞早衰和細胞外基質(zhì)表達。
　　以免疫共沉淀方法驗證ATF4與p16、p21之間的相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以ATF4沉淀抗原后，AGEs組可分別檢測到ATF4-p16和ATF4-p21復(fù)合體存在，而對照組為陰性。ATF4siRNA轉(zhuǎn)染的腎小管上皮細胞與AGEs孵育后，未檢測到ATF4-p16和ATF4-p21復(fù)合體條帶。ATF4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染腎小管上后，可檢測到ATF4-p16和ATF4-p21復(fù)合體存在。上述結(jié)果表明