miR-493-STMN1通路介導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞G2-M期阻滯促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化的機(jī)制.pdf

1、腎間質(zhì)纖維化是多種慢性腎臟病(Chronic kidney diseases，CKD)進(jìn)展至終末期腎?。‥nd stage renal disease,ESRD）的共同病理改變，一旦進(jìn)入ESRD，患者將面臨昂貴的腎臟替代治療費(fèi)用，生活質(zhì)量的顯著降低和生存時(shí)間縮短等嚴(yán)峻問題。因此，找到新的抗纖維化治療方法至關(guān)重要。慢性缺氧不僅是各種慢性腎臟病進(jìn)展至終末期的共同通路，更重要的是它是腎小管間質(zhì)損傷最重要的始動(dòng)因素。近期研究表明，小管上皮細(xì)胞

2、G2/M期阻滯，能夠通過激活成纖維細(xì)胞并促進(jìn)轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子（Transcriptional growth factor–β1，TGF-β1）、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（Connective tissue growth factor，CTGF），Ⅳ型膠原α1（Collagen4A1，COL4A1）及α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的分泌，導(dǎo)致腎臟纖維化，那么，在缺氧微環(huán)境下，腎小管上皮細(xì)胞是否也發(fā)生細(xì)胞周

3、期阻滯進(jìn)而促進(jìn)纖維化呢？以及調(diào)控這一過程的具體分子機(jī)制是什么？都是亟待回答的問題。
　　MiRNAs（microRNAs，miRNAs)是一類內(nèi)源性的非編碼核糖核酸（Ribonucleic acid，RNA），它能夠通過抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯或者促進(jìn)靶基因的降解調(diào)節(jié)基因表達(dá)，與腎間質(zhì)纖維化關(guān)系密切。近年來，研究表明：缺氧能夠誘導(dǎo)大量miRNAs的表達(dá)并產(chǎn)生相應(yīng)的功能。除此之外，一些研究也證明了有些 miRNAs參與細(xì)胞周期的調(diào)控。

4、我們前期通過基因芯片篩選發(fā)現(xiàn)miR-493在缺氧的HK2細(xì)胞中高表達(dá)，進(jìn)一步在單側(cè)輸尿管梗阻（Unilateral ureteral obstruction，UUO）模型及IgA腎?。↖gA nephropathy，IgAN）患者組織中也驗(yàn)證了miR-493呈高表達(dá)。進(jìn)一步，通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，STMN13'-非翻譯區(qū)（3'-Untranslated region，3'-UTR）存在miR-493的潛在結(jié)合位點(diǎn)，而且它們的表達(dá)呈

5、負(fù)相關(guān)。STMN1是細(xì)胞周期的調(diào)控子，能夠編碼stathmin1蛋白，通過調(diào)節(jié)微管的穩(wěn)定性在有絲分裂紡錘體形成中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，即STMN1能夠參與細(xì)胞周期的調(diào)控。由此我們推測(cè)，缺氧微環(huán)境下，miR-493可能通過抑制 STMN1介導(dǎo)了腎小管細(xì)胞周期G2/M期阻滯進(jìn)而促進(jìn)了腎間質(zhì)纖維化，本研究將通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)這一推論。
　　目的：
　　1)研究慢性缺氧在腎小管上皮細(xì)胞G2/M期阻滯及腎間質(zhì)纖維化中的作用。
　　2

6、)研究miR-493在慢性缺氧誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞G2/M期阻滯及腎間質(zhì)纖維化中的作用。
　　3)缺氧微環(huán)境下miR-493-STMN1通路在小管細(xì)胞G2/M期阻滯及腎間質(zhì)纖維化中的調(diào)控作用。
　　4)體內(nèi)抑制miR-493的表達(dá)，驗(yàn)證其逆轉(zhuǎn)腎間質(zhì)纖維化的作用。
　　方法：
　　1)通過流式細(xì)胞術(shù)、Western Blot及免疫組化檢測(cè)缺氧微環(huán)境下細(xì)胞周期改變及腎間質(zhì)纖維化指標(biāo)。
　　2)通過qRT-PCR

7、及原位雜交技術(shù)檢測(cè)缺氧微環(huán)境下miR-493的表達(dá)，然后在HK2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-493模擬物（mimic）及抑制物（inhibitor），通過流式細(xì)胞術(shù)及Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞周期改變及腎間質(zhì)纖維化指標(biāo)。
　　3)通過熒光素報(bào)告基因、Western Blot及qRT-PCR驗(yàn)證miR-493對(duì)STMN1的調(diào)控作用及機(jī)制。然后，在HK2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染STMN1-shRNA體外抑制STMN1的表達(dá)，通過流式細(xì)胞術(shù)及Weste

8、rn Blot法檢測(cè)細(xì)胞周期改變及腎間質(zhì)纖維化指標(biāo)。
　　4)小鼠體內(nèi)注射miR-493 spongeAAV，通過qRT-PCR、免疫組化及Western Blot法驗(yàn)證下調(diào)miR-493后對(duì)腎間質(zhì)纖維化的逆轉(zhuǎn)作用。
　　結(jié)果：
　　1)慢性缺氧能夠介導(dǎo)小管上皮細(xì)胞G2/M期阻滯及腎間質(zhì)纖維化。
　　首先通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)缺氧處理的HK2細(xì)胞周期變化，發(fā)現(xiàn)G2/M期比例增加，進(jìn)一步通過Western Blot法檢

9、測(cè)缺氧處理的HK2細(xì)胞及UUO模型發(fā)現(xiàn)：G2/M期標(biāo)志（cyclinB1/cyclinD1）隨缺氧及梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)增加，同時(shí)纖維化相關(guān)因子CTGF、COL4A1及α-SMA的表達(dá)增加。在UUO模型中，免疫組化結(jié)果顯示：G2/M期標(biāo)志（PH3/Ki67）在UUO14d后升高，并且Masson染色顯示腎間質(zhì)纖維化程度增加，表明缺氧微環(huán)境能夠介導(dǎo)小管上皮細(xì)胞G2/M期阻滯及腎間質(zhì)纖維化。
　　2)在缺氧微環(huán)境下miR-493高表達(dá)，

10、并且能夠誘導(dǎo)小管上皮細(xì)胞G2/M期阻滯及腎間質(zhì)纖維化。
　　我們通過qRT-PCR檢測(cè)缺氧處理的HK2細(xì)胞及IgAN患者組織中miR-493的表達(dá)，結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，miR-493高表達(dá)，且原位雜交術(shù)也顯示miR-493在UUO14d后表達(dá)增加。然后，在HK2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-493mimic及inhibitor，通過流式細(xì)胞術(shù)及Western Blot發(fā)現(xiàn)：miR-493mimic能夠增加小管細(xì)胞G2/M期比例且促進(jìn)纖維化

11、相關(guān)因子的表達(dá)，相反，miR-493 inhibitor能夠逆轉(zhuǎn)這一改變。
　　3)miR-493在轉(zhuǎn)錄后水平抑制STMN1的翻譯，介導(dǎo)小管上皮細(xì)胞G2/M期阻滯及腎間質(zhì)纖維化。
　　首先，生物信息預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)STMN1是miR-493的靶基因，進(jìn)一步通過熒光素報(bào)告基因驗(yàn)證了miR-493能夠直接調(diào)控STMN1。隨后，通過轉(zhuǎn)染miR-493mimic檢測(cè)STMN1的mRNA及蛋白水平發(fā)現(xiàn)：miR-493在轉(zhuǎn)錄后水平抑制STMN1

12、的翻譯調(diào)控STMN1的表達(dá)。最后，在UUO模型中檢測(cè)STMN1的表達(dá)發(fā)現(xiàn)：隨梗阻時(shí)間增加表達(dá)降低；免疫組化及Masson結(jié)果顯示：UUO14d后，STMN1表達(dá)降低同時(shí)間質(zhì)纖維化程度增加。體外轉(zhuǎn)染STMN1 shRNA抑制STMN1的表達(dá)發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染STMN1 shRNA后，G2/M期標(biāo)志（cyclinB1/cyclinD1）表達(dá)增加，同時(shí)纖維化相關(guān)因子CTGF，COL4A1及α-SMA的表達(dá)增加。
　　4)體內(nèi)干預(yù)m

13、iR-493的表達(dá)能夠抑制腎間質(zhì)纖維化。
　　在小鼠體內(nèi)，通過注射miR-493 sponge腺相關(guān)病毒(Aeno-associated virus,AAV)抑制miR-493的表達(dá)，結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，miR-493 sponge AAV能夠降低纖維化相關(guān)分子α-SMA及COL4A1的表達(dá)，增加STMN1的表達(dá)，提示干預(yù)miR-493的表達(dá)能夠抑制腎間質(zhì)纖維化。
　　結(jié)論：綜上所述，我們研究表明miR-493在缺氧微環(huán)