瀉心湯有效成分抗糖尿病腎病活性的體外研究：對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的保護(hù)作用.pdf

1、糖尿病(diabetes Mellitus，DM)及其并發(fā)癥嚴(yán)重危害人們健康及生存質(zhì)量。糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是DM最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，也是糖尿病患者重要的死亡原因。較高的血糖水平可以誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)成肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast，MyoF)。MyoF作為組織纖維化的效應(yīng)細(xì)胞，直接參與腎小管間質(zhì)纖

2、維化(tubular interstitialfibrosis，TIF)過程。
　　“三黃瀉心湯”亦稱“瀉心湯”，出自《金匱要略》，由黃連、大黃、黃芩三味中藥組成，具有瀉火解毒、清熱燥濕、除痞止血之功效，是中醫(yī)臨床治療胃火邪內(nèi)熾證的常用方劑。瀉心湯具有多種藥理作用，現(xiàn)代臨床應(yīng)用于急性胃腸炎、肝炎、膽囊炎、口腔炎、痢疾以及外科瘡瘍，凡屬心胃火盛者，均可用本方加減治療。目前瀉心湯已臨床應(yīng)用于糖尿病腎病的治療，但其機(jī)制尚未完全闡明。整體

3、動(dòng)物研究證實(shí)，該方具有降低血糖的作用，其抗糖尿病腎病作用是否獨(dú)立于降血糖作用值得關(guān)注。
　　本課題擬通過研究瀉心湯有效成分對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮HK-2細(xì)胞氧化應(yīng)激、轉(zhuǎn)分化及遷移的作用，為探討瀉心湯抗糖尿病腎病的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第一部分瀉心湯有效成分對(duì)高糖誘導(dǎo)HK-2氧化應(yīng)激的影響
　　目的:研究瀉心湯的有效成分大黃酸、小檗堿和黃芩苷對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的作用。
　　方法:體外

4、高糖培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，藥物處理組加入不同濃度的大黃酸、小檗堿和黃芩苷，孵育24h后收集細(xì)胞上清，采用硫代巴比妥酸法檢測MDA的含量，黃嘌呤氧化酶法檢測SOD活力。
　　結(jié)果:1、高糖作用HK-2細(xì)胞24h后，其上清液中MDA含量比正常組(NG)升高了25.21％(p＜0.01)，滲透壓對(duì)照組(MAN)無明顯變化。藥物干預(yù)后，與高糖組(HG)相比，大黃酸2μg/ml、5μg/ml組細(xì)胞上清MDA含量分別降低6.16％、18.90％(

5、p＜0.05或p＜0.01)，小檗堿2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml組細(xì)胞上清MDA含量分別下降12.24％、20.95％、9.53％(p＜0.05或p＜0.01)，黃芩苷2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml組細(xì)胞上清MDA含量分別下降21.45％、15.04％、18.41％(p＜0.05或p＜0.01)。
　　2、高糖作用HK-2細(xì)胞24h后，細(xì)胞上清液中SOD酶活力比NG下降了27.96％(p＜0.01)，MA

6、N組無明顯變化。藥物干預(yù)后，與HG組比相，大黃酸5μg/ml、10μg/ml組SOD酶活力分別升高了21.41％、27.37％(p＜0.05或p＜0.01)，小檗堿2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml組SOD酶活力分別升高了23.15％、28.12％、30.02％(p＜0.05或p＜0.01)，黃芩苷2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml組SOD酶活力分別升高了40.59％、27.35％、38.52％(p＜0.01)。

7、　　結(jié)論:瀉心湯的三個(gè)有效成分大黃酸、小檗堿和黃芩苷均可提高SOD的活性及減少M(fèi)DA的產(chǎn)生，提示瀉心湯可通過抑制高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激發(fā)揮腎保護(hù)作用。
　　第二部分瀉心湯有效成分對(duì)高糖誘導(dǎo)HK-2的轉(zhuǎn)分化作用的影響
　　目的:研究瀉心湯有效成分大黃酸、小檗堿和黃芩苷對(duì)高糖誘導(dǎo)的人近端腎小管上皮細(xì)胞株(HK-2)的轉(zhuǎn)分化作用。
　　方法:1、體外高糖培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，藥物處理組加入不同濃度的大黃酸、小檗堿和黃芩苷(2μg/m

8、l、5μg/ml、10μg/ml)，孵育48h后western blot法檢測α-SMA蛋白的表達(dá)變化。
　　2、體外培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，顯微鏡觀察高糖(30mmol/L)及大黃酸、小檗堿、黃芩苷分別為5μg/ml時(shí)對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響。
　　結(jié)果:1、NG組α-SMA蛋白微量表達(dá)， MAN組與NG組相比α-SMA表達(dá)未見顯著性差異，高糖刺激48h后α-SMA表達(dá)與正常組相比升高了20.03％(p＜0.01);與HG組相比，大黃酸

9、(2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml)能明顯抑制高糖誘導(dǎo)的α-SMA蛋白表達(dá)，分別下降11.67％、13.33％、12.50％(p＜0.05或p＜0.01);小檗堿(5μg/ml、10μg/ml)能明顯抑制高糖誘導(dǎo)的α-SMA蛋白表達(dá)，分別下降10.05％、17.65％(p＜0.05或p＜0.01);黃芩苷(5μg/ml、10μg/ml)能明顯抑制高糖誘導(dǎo)的α-SMA蛋白表達(dá)，分別下降9.09％、11.88％(p＜0.05或p＜

10、0.01)。
　　2、正常的HK-2細(xì)胞間連接緊密，呈鋪路石樣排列。甘露醇對(duì)細(xì)胞形態(tài)無明顯影響。高糖刺激48h，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，拉長為梭形，排列不緊密。大黃酸、小檗堿和黃芩苷組視野下梭形細(xì)胞數(shù)目明顯減少，可見鋪路石樣細(xì)胞。
　　結(jié)論:瀉心湯的三個(gè)有效成分大黃酸、小檗堿和黃芩苷均可下調(diào)α-SMA蛋白表達(dá)，提示瀉心湯可能具有不依賴于調(diào)控血糖的直接腎保護(hù)作用。
　　第三部分瀉心湯有效成分對(duì)高糖誘導(dǎo)HK-2遷移的影響

11、r>　　目的:研究瀉心湯有效成分對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞遷移的抑制作用和機(jī)制。
　　方法:1、體外高糖培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，大黃酸、小檗堿和黃芩苷干預(yù)10d，transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力。
　　2、體外高糖培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，藥物處理組加入不同濃度的大黃酸、小檗堿和黃芩苷，western blot方法檢測FAK蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:1、transwell實(shí)驗(yàn)中，與正常組（10.47±1.33細(xì)胞數(shù)/視野）相比，滲透

12、壓對(duì)照組細(xì)胞遷移沒有明顯變化（10.60±1.56細(xì)胞數(shù)/視野），高糖刺激10d后細(xì)胞遷移顯著增加(66.47±7.29細(xì)胞數(shù)/視野，p＜0.01)，為NG組的6.35倍;大黃酸(5μg/ml)、小檗堿(5μg/ml)、黃芩苷(5μg/ml)能顯著抑制高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移(45.53±9.72、17.73±3.48、19.93±4.39細(xì)胞數(shù)/視野，p＜0.05或p＜0.01)。
　　2、與NG組相比，MAN組FAK蛋白表達(dá)未見顯著

13、性差異，高糖刺激7d后FAK表達(dá)明顯升高了28.73％(p＜0.01);與HG組相比，大黃酸組FAK蛋白表達(dá)無明顯變化;小檗堿5μg/ml、10μg/ml組FAK蛋白表達(dá)分別降低22.18％、26.59％(p＜0.05或p＜0.01);黃芩苷5μg/ml、10μg/ml組FAK蛋白表達(dá)分別降低25.18％、22.93％(p＜0.01)。
　　結(jié)論:瀉心湯的三個(gè)有效成分大黃酸、鹽酸小檗堿和黃芩苷均可抑制高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞遷移，提示