糖尿病腎病腎小管上皮自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)研究.pdf

1、糖尿病腎病是糖尿病最嚴(yán)重并發(fā)癥之一，且發(fā)病率不斷增加，已成為全球范圍內(nèi)一個(gè)嚴(yán)重的健康問(wèn)題，故目前迫切需要尋找新的針對(duì)糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制的靶向分子或細(xì)胞治療機(jī)制，以期更好的防治糖尿病腎病。近期，營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩及ROS、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、缺氧等細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激被認(rèn)為糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制，而自噬在這些機(jī)制中起著重要作用。自噬是對(duì)多種應(yīng)激的適應(yīng)性反應(yīng)，損傷細(xì)胞、受損細(xì)胞器及大分子蛋白質(zhì)聚積都可激活自噬信號(hào)通路，從而維持應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。既往研究提示，自

2、噬與糖尿病其他并發(fā)癥密切相關(guān)，在胰島素抵抗時(shí)，自噬明顯增加，以保護(hù)胰島p細(xì)胞免受傷害。所以我們推斷，自噬在早期糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制中也可能起著重要作用，對(duì)糖尿病腎病有潛在保護(hù)作用。
　　在細(xì)胞或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，LC3蛋白被認(rèn)為是自噬存在的標(biāo)志分子。LC3-Ⅱ的多少與自噬泡數(shù)量成正比，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ的變化可以判斷細(xì)胞內(nèi)的自噬狀態(tài)。p62蛋白，也稱sequestosome1，與泛素化蛋白結(jié)合后，通過(guò)與LC3相互作用而定位在自噬體

3、上，且不斷地被自噬體-溶酶體系統(tǒng)降解。當(dāng)自噬功能減弱時(shí)，p62相關(guān)聚集體的大小和數(shù)量明顯增加，p62本身的蛋白水平也明顯增高。在本研究中，我們通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，在STZ誘導(dǎo)的Ⅰ型糖尿病腎病大鼠模型和高葡萄糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞模型中，檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3和p62的表達(dá)變化，以闡明糖尿病腎病小管細(xì)胞是否存在自噬障礙。
　　目的:1.觀察Ⅰ型糖尿病腎病大鼠模型腎臟中自噬相關(guān)蛋白LC3、p62的表達(dá)情況。2.研究高葡萄糖對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞

4、（HK-2）LC3、p62表達(dá)的影響
　　方法:1）體內(nèi)實(shí)驗(yàn):①建立STZ誘導(dǎo)的Ⅰ型DN大鼠模型:將20只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組和糖尿病腎病模型組。采用尾靜脈注射STZ的方法誘發(fā)SD大鼠糖尿病腎病（STZ為50mg/kg）。對(duì)照組注射相同體積的枸櫞酸鹽緩沖液，3天后開始測(cè)定血糖和尿糖值，當(dāng)血糖值≥16.7mmol/L，尿糖值為+++～++++者可確定為糖尿病模型。成模后第八周處死大鼠，留部分腎皮質(zhì)組織，4％多聚甲醛固定。②

5、進(jìn)行HE染色觀察兩組間腎組織病理改變。③免疫組織化學(xué)檢測(cè)兩組間腎組織LC3和P62蛋白表達(dá)及分布情況。④采用Pearson相關(guān)分析評(píng)判LC3、p62與STZ大鼠蛋白尿、肌酐的相關(guān)性。
　　2)體外實(shí)驗(yàn):HK-2人腎小管上皮細(xì)胞作為體外實(shí)驗(yàn)觀察對(duì)象，常規(guī)低糖DMEM+10％FBS培養(yǎng)，給予不同濃度右旋葡萄糖(10、20、30mmol/l)刺激48小時(shí)，采用Western Blot檢測(cè)各組LC3、p62蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果:

6、1）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:①STZ誘導(dǎo)的Ⅰ型DN大鼠的血尿生化檢測(cè)結(jié)果:血糖波動(dòng)19.2-23.3mmol/l;血肌酐波動(dòng)在72.5-122.7umol/l;尿蛋白波動(dòng)在4.63-9.19g/24h②STZ大鼠模型基本病理改變:與正常對(duì)照組相比，可見腎小球體積明顯增大，腎小管局灶性萎縮，小管間質(zhì)造型纖維化，基底膜增厚，系膜細(xì)胞及系膜基質(zhì)增多。③p63、LC3免疫組化結(jié)果:腎組織小管上皮中，p62表達(dá)明顯增加，LC3表達(dá)明顯下降，定量分析結(jié)果顯示

7、，STZ大鼠腎組織小管中，p62較正常組增加2.5倍，LC3下降35％(p＜0.01)④p62、LC3表達(dá)與蛋白尿、血肌酐的相關(guān)性分析，提示: p62與STZ大鼠蛋白尿、肌酐呈正相關(guān)(P＜0.01)，LC3與STZ大鼠蛋白尿、肌酐呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)
　　2)體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果:高葡萄糖引起p62上升，LC3下降，呈現(xiàn)劑量依賴性，而相同滲透性的甘露醇無(wú)此效應(yīng)，提示自噬改變與滲透壓無(wú)關(guān)。
　　結(jié)論:(1) STZ誘導(dǎo)的Ⅰ型DN大