胞質(zhì)M-CSF對HeLa細(xì)胞增殖、運(yùn)動和侵襲的影響及機(jī)制.pdf

1、目的：建立一個穩(wěn)定高表達(dá)胞質(zhì)M-CSF 的細(xì)胞系，并以此細(xì)胞系為模型，探討胞質(zhì)M-CSF 對細(xì)胞增殖、運(yùn)動和侵襲能力的影響及其作用機(jī)制。 方法：分別將胞質(zhì)定位空載體pCMV/cyto/myc 與重組載體pCMV/cyto/myc-M-CSF 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HeLa 細(xì)胞，用G418 篩選陽性克隆，RT-PCR、Western blot 鑒定M-CSF 的表達(dá)；免疫細(xì)胞化學(xué)驗證M-CSF 蛋白的定位。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)；細(xì)胞計數(shù)

2、、MTT 法及反義寡核苷酸抑制實驗分析M-CSF 對細(xì)胞增殖的影響；半定量RT-PCR 觀察胞質(zhì)M-CSF 對G1 期細(xì)胞周期相關(guān)蛋白、Rho GTP酶（Rac1）基因、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP2、MMP9）的轉(zhuǎn)錄的影響；體外細(xì)胞遷移和侵襲實驗顯示胞質(zhì)M-CSF 對HeLa 細(xì)胞遷移和侵襲的影響；免疫熒光觀察cdc42 和細(xì)胞骨架的改變；明膠酶譜實驗檢測活性MMP 的表達(dá)。 結(jié)果： RT-PCR、Western blot 實驗顯示

3、：轉(zhuǎn)染M-CSF 的HeLa 細(xì)胞（命名為HeLa-M 細(xì)胞）高表達(dá)M-CSF，與轉(zhuǎn)染空載體HeLa 細(xì)胞（命名為HeLa-C 細(xì)胞）和HeLa 細(xì)胞比較有顯著差異性（P ＜0.01），免疫細(xì)胞化學(xué)顯示：HeLa-M細(xì)胞表達(dá)的M-CSF 蛋白定位于胞質(zhì)，提示：實驗成功建立了一個穩(wěn)定表達(dá)胞質(zhì)M-CSF 的HeLa細(xì)胞系。與HeLa-C 細(xì)胞和HeLa 細(xì)胞比較，HeLa-M 細(xì)胞體積增大、倍增時間縮短、生長速度增快， M-CSF 特異性反

4、義寡核苷酸能抑制HeLa-M細(xì)胞的增殖速度，但對HeLa-C 細(xì)胞和HeLa細(xì)胞增殖影響較小，提示：HeLa-M細(xì)胞增殖速度增快與細(xì)胞胞質(zhì)M-CSF 相關(guān)。HeLa-M 細(xì)胞微管蛋白在胞核周呈圓環(huán)狀，放射狀排列，較粗厚，而HeLa-C 細(xì)胞和HeLa 細(xì)胞微管蛋白彌漫分布呈細(xì)絲狀。HeLa-M 細(xì)胞的cyclinE/D1/D3 、CDK2/4/6、Rho GTP 酶（Rac1）、Rho GTP酶相關(guān)蛋白cdc42 和基質(zhì)金屬蛋白酶（MM

5、P2）表達(dá)顯著升高（P ＜0.01），但cyclinD2、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP9）的表達(dá)沒有明顯變化。Transwell 體外細(xì)胞遷移實驗顯示：體外細(xì)胞遷移和侵襲實驗發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組HeLa 細(xì)胞遷移和侵襲能力均明顯高于對照組（P ＜0.01）；明膠酶譜實驗發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞能顯著增強(qiáng)胞外活性MMP2 的分泌（P ＜0.01）。 結(jié)論：建立了一個穩(wěn)定高表達(dá)胞質(zhì)M-CSF 的細(xì)胞系。胞質(zhì)M-CSF上調(diào)cyclinE/D1/D3 、CDK2