細(xì)胞質(zhì)M-CSF對(duì)NIH 3T3細(xì)胞增殖和運(yùn)動(dòng)的影響.pdf

1、目的:建立胞質(zhì)內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)M-CSF的細(xì)胞系;探討定位在胞質(zhì)內(nèi)的M-CSF對(duì)細(xì)胞增殖和運(yùn)動(dòng)的影響。
　　方法:PCR分別擴(kuò)增人 M-CSF的胞外活性區(qū)和功能區(qū),連接到胞漿定位載體pCMV/cyto/myc質(zhì)粒,得重組質(zhì)粒pCMV/cyto/myc-h-M-CSF,再將重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞,得到分別穩(wěn)定表達(dá)M-CSF的胞外活性區(qū)和功能區(qū)的細(xì)胞株。免疫細(xì)胞化學(xué)驗(yàn)證M-CSF蛋白的定位,細(xì)胞生長曲線和致傷愈合實(shí)驗(yàn)顯示外源的M-

2、CSF對(duì)NIH3T3細(xì)胞增殖和運(yùn)動(dòng)的影響。考馬斯亮蘭對(duì)細(xì)胞骨架進(jìn)行染色。
　　結(jié)果:重組基因的插入片段大小分別與M-CSF的胞外區(qū)和功能區(qū)相符,重組的M-CSF片段無閱讀框移位和突變,綠色熒光蛋白僅定位在NIH3T3細(xì)胞質(zhì)內(nèi),表明成功構(gòu)建胞漿定位表達(dá)載體 pCMV/cyto/myc-M-CSF-a和pCMV/cyto/myc-M-CSF-d;分別將pCMV/cyto/myc-M-CSF-a和pCMV/cyto/myc-M-CSF-

3、d質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞,并經(jīng)G418篩選后,穩(wěn)定表達(dá)M-CSF胞外區(qū)和功能區(qū)的NIH3T3細(xì)胞株其倍增時(shí)間均短于對(duì)照細(xì)胞;胞質(zhì)內(nèi)M-CSF誘導(dǎo)NIH3T3細(xì)胞微絲重構(gòu)和細(xì)胞遷移;M-CSF N末端149個(gè)氨基酸殘基組成的功能區(qū)其促NIH3T3細(xì)胞增殖和運(yùn)動(dòng)活性與M-CSF的胞外區(qū)基本相同。
　　結(jié)論:建立了一個(gè)細(xì)胞質(zhì)穩(wěn)定表達(dá)M-CSF的細(xì)胞系;細(xì)胞質(zhì)M-CSF能誘導(dǎo)NIH3T3細(xì)胞增殖,增強(qiáng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力;M-CSF蛋白的功能區(qū)