構(gòu)建抗CD90抗體偶聯(lián)去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣膜的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分 去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣膜支架制備方法的改進(jìn)
　　 金屬基質(zhì)蛋白酶抑制劑在去細(xì)胞瓣膜支架制備中的應(yīng)用
　　 目的：研究去細(xì)胞過(guò)程中瓣膜內(nèi)金屬基質(zhì)蛋白酶(MMP)及細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的變化,并采用新型的MMP抑制劑-Galardin來(lái)干預(yù)MMP的作用,旨在維持ECM的完整性。
　　 方法：取豬新鮮主動(dòng)脈瓣膜,抗生素消毒,PBS沖洗。瓣膜分為三組:組一用0.5％曲拉通和0.5％脫氧膽酸的溶液搖床震蕩24小時(shí);組二

2、0.5％曲拉通、0.5％脫氧膽酸和84 mmol/L Galardin的溶液搖床震蕩24小時(shí),兩組PBS沖洗后,于含20μ g/ml Rnase Ⅰ和200 μg/ml Dnase Ⅰ的PBS溶液作用1小時(shí),PBS清洗備用。組三正常瓣膜作為對(duì)照組。應(yīng)用常規(guī)HE和Ⅰ型膠原免疫組化染色,光鏡和電子掃描顯微鏡檢查,評(píng)價(jià)去細(xì)胞效果和ECM變化。DNA含量分析,評(píng)價(jià)細(xì)胞核酸去除的效果。明膠酶譜分析觀察各組間MMP的活性差別。
　　 結(jié)果：

3、HE染色、Ⅰ型膠原免疫組化染色、掃描電鏡及DNA含量分析的結(jié)果均表明,經(jīng)曲拉通和脫氧膽酸處理的豬主動(dòng)脈瓣膜無(wú)明顯細(xì)胞殘余,ECM的基本結(jié)構(gòu)保持完整。當(dāng)加入MMP抑制劑-Galardin后,對(duì)去細(xì)胞效果、DNA含量和ECM的結(jié)構(gòu)無(wú)明顯影響。明膠酶譜分析結(jié)果提示單純曲拉通和脫氧膽酸處理后的瓣膜仍有一定量的MMP殘留。而當(dāng)加入Galardin后,可基本抑制瓣膜中MMP的活性。
　　 結(jié)論：曲拉通加脫氧膽酸鈉法可以有效去除正常心臟瓣膜的

4、細(xì)胞成分,對(duì)瓣膜結(jié)構(gòu)影響較小,是一種有效的去細(xì)胞方法。該方法聯(lián)合MMP抑制劑-Galardin,可抑制瓣膜中MMP的活性,以減少M(fèi)MP對(duì)瓣膜ECM的破壞。
　　 第二部分 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的獲取及抗體相容性實(shí)驗(yàn)
　　 目的：探討體外培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的可行性,觀察體外培養(yǎng)的MSC的生物學(xué)特性,分析其表型特點(diǎn),檢測(cè)MSC與抗CD90抗體共培養(yǎng)后的增殖情況,為進(jìn)一步研究抗體偶聯(lián)瓣膜奠定基礎(chǔ)。
　　 方法

5、：采用全骨髓直接貼壁法獲得原代大鼠MSC,差速貼壁結(jié)合消化控制法純化和擴(kuò)增細(xì)胞。鏡下觀察細(xì)胞生物學(xué)形態(tài)及生長(zhǎng)狀態(tài),細(xì)胞計(jì)數(shù)繪制生長(zhǎng)曲線,流式細(xì)胞儀對(duì)第3代MSC的表型檢測(cè),激光共聚焦顯微鏡及免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)其表面分子CD90、Ⅰ型膠原蛋白和α平滑肌肌動(dòng)蛋白(ASMA)表達(dá)。并用抗CD90抗體與MSC共培養(yǎng)一段時(shí)間,應(yīng)用MTT試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)MSC的增殖情況。
　　 結(jié)果：大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞光鏡下可見(jiàn)MSC呈梭形、紡錘形和多角形,核

6、居中,有1～2個(gè)核仁。免疫熒光染色顯示ASMA。免疫組織化學(xué)染色顯示MSC分泌Ⅰ型膠原蛋白,長(zhǎng)期培養(yǎng)未見(jiàn)向成骨細(xì)胞分化。在第7代以前,MSC增殖速度較快,細(xì)胞接種后1～2天為滯留期,3天后達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,第6天進(jìn)入平臺(tái)期。流式細(xì)胞儀檢測(cè)示MSC表達(dá)CD90,不表達(dá)CD45和CD34,激光共聚焦顯微鏡示CD90表達(dá)于細(xì)胞表面。當(dāng)MSC與抗CD90抗體共同培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)后,通過(guò)MTT試驗(yàn)所測(cè)得的平均吸光度與對(duì)照組無(wú)顯差別(P＞0.05

7、)。
　　 結(jié)論：差速貼壁結(jié)合消化控制法易于分離、擴(kuò)增MSC,易獲得大量高純度的MSC。在體外培養(yǎng)條件下細(xì)胞生長(zhǎng)性狀穩(wěn)定,并陽(yáng)性表達(dá)相應(yīng)的細(xì)胞表面分子CD90。體外MSC與抗CD90抗體共同培養(yǎng)示抗CD90抗體對(duì)MSC無(wú)明顯的細(xì)胞毒性作用。
　　 第三部分 去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣的抗體表面修飾及體外實(shí)驗(yàn)
　　 一.抗CD90抗體偶聯(lián)去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣的制備
　　 目的：研究去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣膜與生物素、親和素和抗C

8、D90抗體的結(jié)合能力,制備偶聯(lián)抗CD90抗體的去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣膜。
　　 方法：制備去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣膜,實(shí)驗(yàn)組將生物素與去細(xì)胞主動(dòng)脈瓣膜反應(yīng),使瓣膜表面生物素化。陰性對(duì)照組:①未與生物素反應(yīng)的去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣;②加入能破壞生物素的二硫蘇糖醇(DTT),余反應(yīng)步驟相同。去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣裁剪成8×8mm2,分6組(n=8),分別加入不同量的生物素(0.5 μ mol,0.75μmol,1.0 μ mol,1.5 μ mol,2.0μ

9、 mol和2.5 μ mol)。FITC-親和素檢測(cè),用激光共聚焦半定量技術(shù)確定生物素的飽和濃度?？笴D90抗體偶聯(lián)實(shí)驗(yàn)分四組,實(shí)驗(yàn)組:應(yīng)用親和素與生物素化的去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣反應(yīng),制備表面含親和素的生物素化去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣。最后,將生物素化抗CD90抗體連接到修飾后的去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣。陰性對(duì)照組:①生物素化的去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣,不加親和素,直接加入生物素化的小鼠抗大鼠CD90,再加入羅丹明標(biāo)記的抗小鼠的IgG抗體;②生物素化的去細(xì)胞豬主動(dòng)

10、脈瓣,加親和素,不加生物素化的抗大鼠CD90,再加入羅丹明標(biāo)記的抗小鼠的IgG抗體;③生物素化的去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣,加親和素,再加入生物素化的抗大鼠CD90,不加羅丹明標(biāo)記的抗小鼠的IgG抗體。去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣裁剪成8×8mm,分5組(n=8),加入濃度為6mM的生物素250 μl冰上反應(yīng)2 h,分別加入不同量的親和素(25 μ g,125 μ g,250 μ g,500 μ g和750 μg),再加入生物素化小鼠抗大鼠CD90抗體,羅丹

11、明標(biāo)記的二抗檢測(cè),用激光共聚焦半定量技術(shù)確定親和素的飽和濃度?？贵w偶聯(lián)去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣細(xì)胞接觸毒性試驗(yàn),Giemsa染色觀察與瓣膜接觸面細(xì)胞增殖情況,掃描電鏡觀察瓣膜表面細(xì)胞生長(zhǎng)情況,了解抗CD90抗體偶聯(lián)豬去細(xì)胞主動(dòng)脈瓣對(duì)MSC是否有細(xì)胞毒性。
　　 結(jié)果：瓣膜表面所結(jié)合的生物素量(以親和素的熒光強(qiáng)度表示)逐漸增加。當(dāng)生物素劑量分別為1.5 μmol,2.0 μmol和2.5 μ mol時(shí),瓣膜表面的生物素漸趨飽和。1.5 μ

12、 mol組和2.0 μ mol組,2.0 μ mol組和2.5 μ mol組比較均無(wú)顯著性差異(F值分別為2.263、3.468和0.017,P值分別為0.155、0.084和0.899),然而1.5 μ mol組和2.5 μ mol組比較有顯著性差異(F值為7.861,P值為0.014),故取2.0 μ mol為飽和劑量。隨著親和素劑量的提高,瓣膜表面所結(jié)合的親和量(以二抗的熒光強(qiáng)度表示)逐漸增加。125μ g組和250 μ g組的親

13、和素所結(jié)合的生物素化抗體量有顯著性差異(F值為8.416,P值為0.016),250 μ g組和500 μg組,500 μg組和750 μ g組,250 μ g組和750μ g組比較均無(wú)顯著性差異(F值分別為0.178、0.115和0.017,P值分別為0.682、0.741和0.899),故取250 μg為飽和劑量。CD90抗體偶聯(lián)豬去細(xì)胞主動(dòng)脈瓣對(duì)MSC無(wú)細(xì)胞毒性,不影響細(xì)胞粘附和生長(zhǎng)。
　　 結(jié)論：生物素和親和素能依次偶聯(lián)

14、至去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣,相應(yīng)濃度生物素和親和素修飾后的去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣能在表層偶聯(lián)抗CD90抗體。抗體偶聯(lián)的去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣對(duì)MSC的生長(zhǎng),增殖無(wú)明顯影響。本實(shí)驗(yàn)首次提出利用生物素一親和素系統(tǒng)將抗體偶聯(lián)至去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣。為進(jìn)一步以[生物素-親和素-生物素化抗體]為中介,促進(jìn)細(xì)胞對(duì)去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣的粘附,奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 二.體外模擬流室系統(tǒng)的制備
　　 目的：制備體外模擬流室系統(tǒng),為進(jìn)一步研究偶聯(lián)的抗體在流體環(huán)境下的

15、穩(wěn)定性奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：制備去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣膜。研制應(yīng)用于去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣膜的體外模擬流室系統(tǒng)。搭建體外模擬流室系統(tǒng),調(diào)節(jié)泵的流速,觀察該系統(tǒng)的工作情況。
　　 結(jié)果：針對(duì)生物瓣膜設(shè)計(jì)的模擬流室系統(tǒng)使用簡(jiǎn)便。隨著調(diào)節(jié)泵的流速?gòu)?00ml/min,150ml/min,200ml/min,至250ml/min,對(duì)抗體偶聯(lián)去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣表面剪切力可從25.9 dyne/cm2,38.9 dyne/cm2,51.9 dy

16、ne/cm2增加到64.8dyne/cm2。
　　 結(jié)論：我們自行設(shè)計(jì)的應(yīng)用于心臟瓣膜的模擬流室系統(tǒng)能準(zhǔn)確的對(duì)瓣膜表面施加剪切力,且使用簡(jiǎn)便。
　　 三.抗體偶聯(lián)穩(wěn)定性的研究
　　 目的：在抗體偶聯(lián)去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣膜的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究偶聯(lián)的抗體在流體環(huán)境下的穩(wěn)定性。
　　 方法：制備去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣膜,利用生物素—親和素系統(tǒng)將抗CD90抗體偶聯(lián)至去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣膜。根據(jù)不同的泵轉(zhuǎn)速,實(shí)驗(yàn)分四組,從100

17、ml/min,150ml/min,200ml/min,至250ml/min。瓣膜在體外流室系統(tǒng)中持續(xù)作用12小時(shí)。羅丹明標(biāo)記IgC抗體結(jié)合抗CD90抗體,激光共聚焦顯微鏡下,應(yīng)用Leica Q win軟件,分析瓣膜表層熒光強(qiáng)度。計(jì)算同一個(gè)樣本在流體沖擊前后抗體熒光強(qiáng)度的比值,比較不同剪切力沖擊下抗體熒光強(qiáng)度比值的差別。
　　 結(jié)果：各組間去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣表面抗CD90抗體的紅色熒光強(qiáng)度比值無(wú)顯著性改變(F值為0.203,P值為0

18、.819)。
　　 結(jié)論：應(yīng)用生物素-親和素系統(tǒng)而偶聯(lián)于去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣膜的抗CD90抗體在體外穩(wěn)定性良好,為增加其對(duì)MSC的粘附奠定了基礎(chǔ)。
　　 第四部分 體外抗CD90抗體偶聯(lián)去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣膜對(duì)MSC的捕獲實(shí)驗(yàn)
　　 目的：在去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣偶聯(lián)抗CD90抗體的基礎(chǔ)上,利用模擬層流裝置,體外觀察瓣膜表面的抗CD90抗體能否捕捉MSC,增加MSC對(duì)去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣膜的覆蓋。
　　 方法：抗CD90抗

19、體偶聯(lián)的去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣膜為實(shí)驗(yàn)組,單純?nèi)ゼ?xì)胞豬主動(dòng)脈瓣膜為對(duì)照組。將抗CD90抗體偶聯(lián)的去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣膜嵌固于模擬流室。取第三代MSC消化、離心制成細(xì)胞懸液,調(diào)整密度后將約1.4×106的MSC注入流室系統(tǒng)。調(diào)節(jié)蠕動(dòng)泵流速,流速調(diào)至250 ml/min,轉(zhuǎn)流12 h后,取出瓣膜,掃描電鏡觀察。使用Leica圖像分析系統(tǒng)做細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì),兩組之間比較。
　　 結(jié)果：在1500 μm2的面積內(nèi),抗體偶聯(lián)的去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣膜組有(25

20、.88±3.18)個(gè)粘附。而對(duì)照組僅(6.63±1.69)個(gè)MSC粘附?？贵w偶聯(lián)的去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣膜上的細(xì)胞數(shù)量顯著多與對(duì)照組(P＜0.05),在嵌固環(huán)固定處,未接觸含MSC,支架纖維裸露,未見(jiàn)有細(xì)胞附著。
　　 結(jié)論：偶聯(lián)抗CD90抗體的去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣膜能夠捕捉流體中的MSC,增加MSC對(duì)瓣膜的覆蓋。該研究的意義在于為偶聯(lián)抗體的瓣膜支架捕捉血液中的EPC奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),為改善TEHV功能,促進(jìn)自身修復(fù),延長(zhǎng)使用壽命,提供了新的