去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣RGD表面修飾促進(jìn)細(xì)胞粘附的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、對(duì)于心臟瓣膜疾病最為主要的治療方式仍是手術(shù)進(jìn)行瓣膜置換。目前臨床應(yīng)用的人工心臟瓣膜有機(jī)械瓣和生物瓣兩大類，盡管均能改善和延長(zhǎng)患者的生命，但都未達(dá)到理想程度。機(jī)械瓣需要終生抗凝，有一定的栓塞和出血率；生物瓣則存在衰壞、鈣化的問(wèn)題。同種瓣膜雖優(yōu)于異種生物瓣，但來(lái)源受限，并且也存在衰敗的問(wèn)題。研究與開(kāi)發(fā)組織工程心臟瓣膜是當(dāng)前大勢(shì)所趨。
　　利用去細(xì)胞瓣構(gòu)建組織工程心臟瓣膜，具有任何高分子可降解材料無(wú)法替代的優(yōu)越性。但是由于在支架材料的去

2、細(xì)胞過(guò)程中，會(huì)同時(shí)去除大量細(xì)胞外可溶性基質(zhì)，其中包括已知的調(diào)控細(xì)胞粘附的蛋白分子。因此在利用去細(xì)胞瓣構(gòu)建組織工程心臟瓣膜時(shí)，如何調(diào)控、促進(jìn)種子細(xì)胞的粘附、增殖和ECM新生，是丞待解決的重要問(wèn)題。借鑒目前對(duì)于“生物惰性材料”通過(guò)“表面修飾”的方式，可以改善或提高其生物相容性、材料的理化性能的成功經(jīng)驗(yàn)，擬對(duì)去細(xì)胞瓣進(jìn)行表面修飾，以改善其理化性能、促進(jìn)種子細(xì)胞的粘附、增殖和分化。生物活性分子RGD肽（精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸）作為天然ECM重

3、要組成，是目前應(yīng)用最廣、最有效的促進(jìn)細(xì)胞粘附的多肽。
　　本研究首先通過(guò)應(yīng)用我們實(shí)驗(yàn)室篩選的，胰蛋白酶+TritonX-100法制備去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣支架，并對(duì)本實(shí)驗(yàn)室篩選的交聯(lián)劑－環(huán)氧氯丙烷處理去細(xì)胞瓣膜支架材料的影響進(jìn)行進(jìn)一步的對(duì)比研究。在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用多肽（序列為YGRGDSP酪氨酸－甘氨酸－精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸－絲氨酸－脯氨酸）與環(huán)氧氯丙烷聯(lián)合對(duì)去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣膜進(jìn)行表面修飾，并研究處理后材料細(xì)胞粘附性的變化。對(duì)去細(xì)胞支

4、架材料的改良，以及通過(guò)交聯(lián)RGD進(jìn)行表面修飾做了初步的嘗試。
　　第一部分去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣膜的制備及環(huán)氧氯丙烷改性后的理化性能實(shí)驗(yàn)。采用胰蛋白酶消化和高滲、低滲性去垢劑TritonX-100漂洗的方法制備去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣，分別用GA、EC以及GA+EC（GE）的方法處理去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣，比較相互之間力學(xué)、組織穩(wěn)定性、組織相容性上的差異。
　　結(jié)果：
　　1、采用胰酶+TritonX-100法能完全脫除豬主動(dòng)脈瓣膜的細(xì)胞

5、成分。
　　2、GA、EC以及GE三種處理方法，均可使APAV在力學(xué)、熱皺縮溫度、體外抗酶解能力上得到加強(qiáng)，并且其中以GE效果最佳。
　　3、動(dòng)物皮下包埋、血漿蛋白及血小板粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EC處理不改變APAV的組織相容性和血液相容性，同時(shí)經(jīng)EC處理的GA組APAV，顯著的降低GA的生物毒性，其組織相容性、血液相容性明顯優(yōu)于GA處理組。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)提示GE處理APAV，能夠明顯改善APAV理化性質(zhì)，降低GA的生

6、物毒性，有利于提高組織相和血液相容性。
　　第二部分環(huán)氧氯丙烷聯(lián)合RGD對(duì)去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣修飾的實(shí)驗(yàn)研究。
　　目的：研究含RGD肽表面修飾的去細(xì)胞瓣對(duì)細(xì)胞粘附性的影響。
　　方法：各不同處理去細(xì)胞瓣組與YGRGDSP肽反應(yīng)，通過(guò)茚三酮法、熒光標(biāo)記顯示法比較各組的結(jié)合率。種植大鼠主動(dòng)脈MFBs，沉淀法檢測(cè)細(xì)胞粘附率。
　　結(jié)果：茚三酮、熒光顯像法各組對(duì)比顯示多肽可很好的交聯(lián)到EC、GE組，最佳反應(yīng)條件為：室溫，1